verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

4 Methoden 57
die Streifen pipettieren. Schließlich wurde die Fokussierung für 1 h bei 200 V, für 1 h bei 500 V, für 1 h bei
500 V ansteigend bis 10.000 V und für 3 h bei 10.000 V durchgeführt. Nach Beendigung der Fokussierung
konnten die IPG-Streifen bis zur weiteren Verwendung bei -7O°C (max. 9-12 Monate) gelagert oder sofort
äquilibriert werden. Dazu wurden die IPG-Streifen 10 min in Äquilibrierungslösung (6 M Harnstoff; 30%
[v/v] Glycerol; 2% [v/v] SDS; 50 mM Tris/HCI; 1% [w/v] DTT; 0,1% [w/v] Bromphenolblau; pH 8,8)
geschüttelt. Danach wurde in Äquilibrierungslösung inkubiert, die zusätzlich 260 mM Jodacetamid enthielt,
was Streifenbildungen im SDS-Gel vermied.
Mit der sich anschließenden SDS-PAGE (2. Dimension) wurden die Proteine nach ihren MW
aufgetrennt, was zu einem zweidimensionalen Punktmuster führte. Die Durchführung der SDS-PAGE
unterschied sich in nur wenigen Punkten von der, die unter 4.38 beschrieben war. Diese
Großformat-SDS-PAGE wurde mit der Protean II-Kammer über Nacht durchgeführt. Das SDS-Gel (15%)
wurde mit dem Puffersystem nach LAEMMLI (1970) ohne Sammelgel hergestellt. Die äquilibrierten
IPG-Streifen wurden kurz in SDS-Elektrophoresepuffer (192 mM Glycin; 0,1% [w/v] SDS; 25 mM Tris/HCl;
pH 8,3) getaucht, auf das SDS-Gel gelegt und mit einem Spatel leicht angedrückt. Anschließend wurde
der IPG-Streifen mit einer 70°C warmen 1%igen Agaroselösung fixiert. Um einen optimalen
Proteintransfer vom IPG-Streifen in das SDS-Gel und eine gleichmäßige Auftrennung der Proteine zu
gewährleisten, wurde die Stromstärke auf 20 mA pro Gel begrenzt.
4.46 In vitro-Transkription/-Translation
Die in vitro-Transkription und die in vitro-Translation waren biochemische Verfahren, bei denen
eukaryontische mRNAs zellfrei, d.h. unter Verwendung entsprechend aufbereiteter Zellextrakte, in vitro
transkribiert und translatiert wurden. In dieser Arbeit wurde das Linked in vitro
SP6/T7-Transcription/Translation Kit nonradioactive (3.5) verwendet. Spiralförmig ineinander verdrehte
(supercoiled) Plasmid-DNA, die den Promotor für die RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 trug,
wurde dabei mit der T7-RNA-Polymerase in m 7 Gppp-Kappen-RNA transkribiert und mit
Kaninchen-Retikulozyten-Lysat zu Biotin-markierten Proteinen, unter Verwendung von an ihrer
ε-Aminogruppe mit Biotin gekoppelten Lysin-tRNA, translatiert (PELHAM und JACKSON, 1976). In einem
zellfreien Transkriptionssystem begann die Translation immer am ersten Start-AUG. Die Synthese von
Proteinen erforderte eine Reihe von Komponenten, die in dem in vitro-System enthalten waren. Hierzu
gehörten u.a. Ribosomen, eine vollständige Mischung von tRNAs, Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Enzyme
und Proteinfaktoren für die Initiation, Elongation und Termination der Proteinbiosynthese, energieliefernde
Systeme sowie K + - und Mg 2+ -Ionen. Für die Transkriptionsreaktion sollten alle verwendeten Materialien
RNase-frei sein. 5 µl 4x T7-Transkriptionspuffer und 0,5 µg Plasmid-DNA wurden zusammenpipettiert und
mit DEPC-H 2 O (aqua dest. mit 0,1% [v/v] DEPC) auf 20 µl aufgefüllt. Der Ansatz wurde kurz
abzentrifugiert und im Anschluss für 15 min bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Abkühlung auf
Eis terminiert. Zur Translationsreaktion wurden 10 µl des Transkriptionsreaktionsansatzes und 40 µl des
Translations-Mixes (Retrikulozyten-Lysat) zusammenpipettiert, vorsichtig gemischt, kurz abzentrifugiert
und für 60 min bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Abkühlung auf Eis terminiert. 25 µl des
Ansatzes wurden mit 5 µl des mAK anti-La/SS-B-5B9 (3.12) für weitere 30 min bei 30°C inkubiert. Die
Immunpräzipitation erfolgte unter ständigem Schütteln für 10 min mit 5-15 mg Protein A-gekoppelter
Sepharose. Die Protein A-Sepharose mit gebundenen Immunkomplexen wurde für 10 min bei 16000 g