verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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5 Ergebnisse
5.7 Untersuchung der mRNA-Isoformen auf das Vorkommen einer IRES
Zum eindeutigen Nachweis einer möglichen internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES) in
cDNAs war nur der dicistronen-Test anerkannt. Hierbei wurden zwei exprimierbare, funktionelle
cDNAs mit einem Initiator- und einem Stop-Codon hintereinander gesetzt. Nach der
Transkription entstand eine dicistrone mRNA, bei der zwei vollständige Leserahmen (Cistrons)
hintereinander auf einer mRNA lagen. Nach dem scanning-Model band die 40S-Untereinheit
des Ribosoms an die 5´-Kappe der dicistronen mRNA, lief bis zum ersten geeigneten
Start-AUG, verband sich dort mit der 60S-Untereinheit und translatierte den ersten
Leserahmen. Am Stop-Codon des ersten Leserahmens wurde die Translation unterbrochen,
und das Ribosom zerfiel wieder in seine Untereinheiten. Zu einer internen Initiation am
Start-AUG des zweiten Leserahmens konnte es bei eukaryontischen Zellen nicht mehr
kommen, es sei denn, der zweite Leserahmen enthielt IRES-Elemente (SARNOW et al., 1995).
5.7.1 Klonierung der dicistronen Konstrukte
Zur Untersuchung einer möglichen internen Initiation am Start-AUG im Exon 2 der
murinen La/SS-B-cDNA-Isoformen sollten für die Transfektion in humane HeLa-Zellen
geeignete dicistrone Vektoren mit den verschiedenen 5’-UTRs der murinen La/SS-B-cDNAs
hergestellt werden. Als funktionelle, dicistrone cDNAs wurden Konstrukte, bestehend aus dem
Leserahmen der bakteriellen Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) (GORMAN et al., 1982)
und dem Leserahmen der murinen La/SS-B-cDNAs mit den verschiedenen 5’-UTRs angestrebt.
Der CAT-Leserahmen sollte als eigenständiger, offener Leserahmen vor dem offenen
Leserahmen der jeweiligen murinen La/SS-B-cDNA-Isoformen kloniert werden.
Grundlage dieser Klonierungen bildeten die unter 5.5.1 hergestellten Konstrukte
pcDNA3-Maus-La-Ex1a, pcDNA3-Maus-La-Ex1b und pcDNA3-Maus-La-Ex1c. Die Primer für
die PCR der La/SS-B-cDNA-Isoformen (5.5.1) waren so gewählt worden, dass möglichst viele
Basen der unterschiedlichen 5’-Bereiche und des 3’-Bereichs amplifiziert wurden, da eventuell
vorhandene IRES-Elemente sowohl im 5’- als auch im 3’-Bereich lokalisiert sein konnten. Die
genaue Position ist bis heute jedoch nicht geklärt. Zur Herstellung der CAT-Konstrukte wurden
die unter 5.5.1 hergestellten Konstrukte mit den Restriktionsenzymen EcoR I und Not I verdaut.
Alle zur Herstellung der pcDNA3-Konstrukte verwendeten Vorwärtsprimer besaßen an ihrem
5’-Ende artifizielle EcoR I-Restriktionsschnittstellen und alle Rückwärtsprimer an ihrem 3’-Ende
artifizielle Not I-Restriktionsschnittstellen. Die herausgeschnittenen cDNAs wurden in den
Vektor pCI einkloniert, der mit den Enzymen EcoR I und Not I verdaut worden war. Die
entstanden Konstrukte erhielten die Bezeichnungen pCI-Ex1a-Maus-La, pCI-Ex1b-Maus-La
und pCI-Ex1c-Maus-La (Abb. 14).