verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

5 Ergebnisse 67
Mit allen antisense-Sonden konnten die jeweiligen murinen La/SS-B-mRNA-Isoformen
im Zytoplasma detektiert werden. Damit stellten die murinen La/SS-B-mRNA-Isoformen fertig
gesplissene, zytoplasmatische mRNAs dar. Mit den sense-Sonden konnten keine mRNAs
detektiert werden. Ebenso war keine Färbung der Negativ-Kontrolle zu erkennen, die nur mit
Nachweisreagenz behandelt worden war.
5.4 Expressionsanalyse der mRNA-Isoformen
In diesem Versuch sollte die Expression der drei murinen La/SS-B-mRNA-Isoformen in
verschiedenen Geweben von Balb/c-Mäusen (3.18), Balb/c-Mausembryonen (3.18), murinen
Zellkulturen (3.8) und murinen Primärzellen (3.8) mit der RT-PCR-Technik (4.20) untersucht
werden. Von Interesse war hierbei, ob eine gewebe- bzw. zellspezifische Expression
festzustellen war. Daher musste bei dieser Methode gewährleistet sein, dass sich die drei
murinen La/SS-B-mRNA-Isoformen eindeutig voneinander unterscheiden ließen.
Um bei Zellkulturen eine mögliche proliferationsabhängige Expression feststellen zu
können, wurden die Zellen so ausgesät, dass diese zum Zeitpunkt der RNA-Präparation eine
Konfluenz von mehr als 80% bzw. weniger als 50% besaßen oder im undifferenzierten bzw.
differenzierten Stadium vorlagen. Zur Differenzierung waren zwei der verwendeten Zelllinien
befähigt, die C2C12-Myoblasten und die PCC7-Mz1-Zellen. Während sich die C2C12-Zellen
nach einigen Tagen von selbst zu Muskelgewebe differenzierten, benötigten die
PCC7-Mz1-Stammzellen zur Differenzierung zu neuronalen Zellderivaten des PNS (BERGER
et al., 1997) 0,1 µM all-trans-Retinsäure (RA) und 1 mM dibutyryl-cAMP (dbcAMP) als Zusatz
zum Kulturmedium. Undifferenzierte bzw. differenzierte PCC7-Mz1- und C2C12-Zellen wurden
zur Verfügung gestellt (3.8).
Aus den murinen Zellmaterialien wurde total-RNA isoliert (4.24) und diese durch reverse
Transkription (4.20) in cDNA umgeschrieben. Dies erfolgte mit dem nach stromaufwärts
gerichteten Oligo(dT)-Primer (3.20), dessen Poly(dT)-Sequenz homolog zum Poly(A)-Trakt von
eukaryontischen mRNAs war. Dadurch wurden alle mRNAs in cDNA umgeschrieben, die einen
Poly(A)-Trakt besaßen. Bei der anschließenden PCR (4.18) wurde größtenteils der 5’-Bereich
der cDNAs, der sich zwischen den drei mRNA-Isoformen unterschied, durch spezifische
La/SS-B-mRNA-Isoform-Primer amplifiziert. Die Primer wurden so gewählt, dass die
amplifizierten PCR-Fragemente eine Größe zwischen 350 und 400 bp basaßen, was die
Auftrennung eng zusammenliegender Banden bei der DNA-Agarosegel-Analyse (4.9) unter
Verwendung eines 2%igen LMP-Agarosegels (4.9.1) begünstigte.
Für jede La/SS-B-mRNA-Isoform sollte ein eigenes Primerpaar konstruiert werden. Für
die Exon 1a-und Exon 1c-Isoform war dies möglich, nicht jedoch für die Exon 1b-Form, da der
Vorwärtsprimer in der 27 bp langen Sequenz hätte liegen müssen, um die das Exon 1b im
Vergleich zum Exon 1a verlängert war. Diese Sequenz bot dafür aber keine optimalen