verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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5 Ergebnisse
einen Waschschritt mit Imidazol in niedriger Konzentration (10 mM) wurden unspezifisch
gebundene, bakterielle Proteine von der Säule entfernt. Insgesamt wurden zehn
Waschfraktionen zu je 2 ml aufgefangen. Die Elution des rek. His-tag-Fusionsproteins von der
Säule erfolgte mit Imidazol in höherer Konzentration (150 mM). Hierbei wurden drei
Eluatfraktionen zu je 2 ml erhalten. Da Imidazol nicht die Proteinstruktur beeinflusste, war das
rek. His-tag-Fusionsprotein nativ.
5.9.3 SDS-PAGE und Coomassie-Färbung
Die Überprüfung der Qualität und Quantität der Proteinexpression und
Affinitätsreinigung erfolgte durch eine 10%ige SDS-PAGE (4.38) und anschließender Färbung
des SDS-Gels mit Coomassie-Brillant-Blau (4.39). Aufgetragen wurden jeweils 5 µl des
Totalextrakts, der ersten beiden Waschfraktionen, die erfahrungsgemäß den meiste Anteil an
bakteriellen Proteinen enthielten, und der drei Eluatfraktionen.
Abb. 16: SDS-Gel zur murinen La/SS-B-
Proteinexpression
Als Marker wurde der LMW-Marker (3.16) verwendet.
1) Totalextrakt
2) 1. Waschfraktion mit bakt. Proteinen
3) 2. Waschfraktion mit bakt. Proteinen
4) 1. Eluatfraktion mit rek. murinem La/SS-B-Protein
5) 2. Eluatfraktion mit rek. murinem La/SS-B-Protein
6) 3. Eluatfraktion mit rek. murinem La/SS-B-Protein
Im Totalextrakt (Abb. 16: Laufspur 1) ließen sich viele Proteine nachweisen. In den
Waschfraktionen (Abb. 16: Laufspur 2 und 3) waren keine Proteine zu erkennen, da
wahrscheinlich durch das kontinuierliche Waschen eine so große Verdünnung eingetreten war,
wodurch die Proteinkonzentration unter die Coomassie-Brillant-Blau-Nachweisgrenze gefallen
war. Das rek. His-tag-Fusionsprotein war nur in den ersten beiden der drei Eluatfraktionen
detektierbar (Abb. 16: Laufspuren 4, 5 und 6). Wahrscheinlich konnte es nur auf Grund der
Nachweisgrenze der Coomassie-Färbung nicht mehr in der dritten Eluatfraktion nachgewiesen
werden. Das MW des rek. His-tag-Fusionsproteins lag etwas über 45 kDa, was auf die
zusätzlichen AS des pET28a-Vektors (darunter auch der His-tag) zurückzuführen war.
Die Quantität des rek. His-tag-Fusionsproteins ließ sich im Vergleich mit den
Markerbanden mit bekannten Proteinkonzentrationen im SDS-Gel abschätzen. Bei einer
Auftragungsmenge von 5 µl ergab sich eine Gesamtproteinkonzentration von etwa 0,5 mg/ml.