verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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4 Methoden
4.39 Färbung von SDS-Gelen mit Coomassie-Brillant-Blau
Die unspezifische Proteinfärbung mit Coomassie-Brillant-Blau beruhte auf elektrostatischen
Bindungen und apolaren Wechselwirkungen zwischen dem Farbstoff und dem Protein (ANDREWS,
1986). Coomassie detektierte einzelne Proteinbanden ab 0,1 µg Proteingehalt (HARLOW und LANE,
1988). Die Gele wurden 30 min mit Coomassie-Brillant-Blau-Lösung (2,5% [w/v] Coomassie-Brillant-Blau;
45% [v/v] Methanol; 45% [v/v] aqua dest.; 10% [v/v] Essigsäure) unter Schütteln bei RT inkubiert.
Anschließend wurde der Hintergrund des SDS-Gels mit Coomassie-Brillant-Blau-Entfärbelösung (20%
[v/v] Methanol; 70% [v/v] aqua dest.; 10% [v/v] Essigsäure) solange reduziert, bis die Proteinbanden
sichtbar wurden. Die Gele konnten zwischen zwei Cellophan-Folien bei RT getrocknet werden.
4.40 Western-Blotting
Bei der von BURNETTE (1981) als Western-Blotting bezeichneten Methode wurden
elektrophoretisch aufgetrennte Proteine auf eine PVDF- (Polyvinylidendfluorid-) Trägermembran
(Bindungskapazität 170-200 µg/cm 2 ) elektrophoretisch übertragen, an der sie über hydrophobe
Wechselwirkungen immobilisiert wurden und dann für immunochemische Untersuchungen zur Verfügung
standen (KYHSE-ANDERSEN, 1984; REISER und WARDALE, 1981; BITTNER et al., 1980; TOWBIN et
al., 1979). In dieser Arbeit fand der Semi-Dry-Transfer Anwendung, bei dem nur ein Anfeuchten der
Membran und Filterpapiere erforderlich war (KYHSE-ANDERSEN 1984). Die hydrophobe Oberfläche der
PVDF-Membran wurde durch Inkubation für 10 sec in Methanol und anschließend für 10 min in
Transfer-(Blotting-) Puffer (25 mM Tris/HCl; 192 mM Glycin; 20% [v/v] Methanol; pH 8,3) äquilibriert und
dann dem SDS-Gel aufgelegt. Über und unter das Gel wurde ein mit Transfer-(Blotting-) Puffer
angefeuchteter Filterpapierstapel gelegt. Der Aufbau wurde nun auf den mit Transfer-(Blotting-) Puffer
befeuchteten Grafitelektroden einer Blotting-Apparatur so orientiert, dass das Gel zur Kathode und die
PVDF-Membran zur Anode zeigte. Der Transfer erfolgte für 6 min je Prozentigkeit des SDS-Gels bei einer
Stromstärke von 0,8 mA/cm 2 Membranoberfläche. Nach Beendigung des Transfers wurden die
Marker-Spuren für 1 h mit Coomassie-Brillant-Blau-Lösung (2,5% [w/v] Coomassie-Brillant-Blau; 45% [v/v]
Methanol; 45% [v/v] aqua dest.; 10% [v/v] Essigsäure) unter Schütteln bei RT inkubiert. Danach wurde der
Hintergrund mit Coomassie-Brillant-Blau-Entfärbelösung (20% [v/v] Methanol; 70% [v/v] aqua dest.; 10%
[v/v] Essigsäure) und Methanol reduziert. Schließlich wurde der Markerstreifen getrocknet.
4.41 Immundetektion von Proteinen
Der Western-Blot wurde zum Absättigen freier Bindungsstellen in 1 ml/cm 2 Blockierungs-Lösung
(NBT-X-Phosphat-Färbesystem: 3% [w/v] BSA in 1x TBS; ECL-System: 2% [v/v] Blocking-Reagenz in
1x TBS) über Nacht bei 4°C oder für 1 h bei RT unter Schütteln inkubiert. Der Nachweis von reaktiven
Proteinbanden erfolgte durch indirekte Immunodetektion. Hierbei wurden die primären AK (3.12) durch mit
Enzymen gekoppelte sekundäre AK (3.13) spezifisch erkannt. Alle Inkubations- und Waschschritte fanden
auf dem Wippschüttler bei RT statt. Nach Entfernung der Blockierungs-Lösung wurde der Blot kurz mit