verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

Verzeichnisse
III
5.7 Untersuchung der mRNA-Isoformen auf das Vorkommen einer IRES ..........................................80
5.7.1 Klonierung der dicistronen Konstrukte......................................................................................80
5.7.2 Transiente Transfektion und Immuno-Blotting..........................................................................82
5.8 Suche nach weiteren mRNA-Isoformen .........................................................................................84
5.8.1 Suche nach weiteren alternativen 5’-mRNA-Isoformen durch 5’-RACE...................................84
5.8.2 Suche nach splice-mRNA-Isoformen durch RT-PCR...............................................................84
C) Untersuchung des murinen La/SS-B-Proteins ...................................................................................85
5.9 Bakterielle Expression ....................................................................................................................85
5.9.1 Klonierung des bakteriellen Expressionvektors ........................................................................85
5.9.2 Expression und Aufreinigung ....................................................................................................85
5.9.3 SDS-PAGE und Coomassie-Färbung.......................................................................................86
5.9.4 Western-Blotting und Immundetektion .....................................................................................87
5.10 Hochauflösende 2D-Gelelektrophorese .......................................................................................88
5.11 Untersuchung des Einflusses von NO auf das murine La/SS-B-Protein......................................90
5.11.1 Quantifizierung........................................................................................................................90
5.11.2 Lokalisationsanalyse...............................................................................................................92
5.12 Induktion von Autoantikörpern durch Immunsierung des humanen neo-La-Epitops ...................93
5.12.1 Nachweis von Autoantikörpern durch ELISA ..........................................................................94
5.12.2 Nachweis von Autoantikörpern durch Immuno-Blotting..........................................................96
5.12.3 Nachweis von Autoantikörpern durch immunzytochemische Färbung ...................................96
5.12.4 Zusammenhang zwischen ANAs und einer zellschädigenden Vorläuferreaktion...................97
6 DISKUSSION..........................................................................................................................................99
A) Analyse des murinen La/SS-B auf genomischer Ebene ....................................................................99
6.1 Allgemeine Merkmale des Strukturgens.........................................................................................99
6.2 Sequenzunterschiede.....................................................................................................................99
6.3 Die Exons und Introns ..................................................................................................................100
6.4 Der Basis-Promotor......................................................................................................................102
6.5 Der alternative Promotor ..............................................................................................................105
6.6 Der alternative splice-Mechanismus.............................................................................................107
6.7 Vergleich der alternativen Exon 1 des murinen und humanen La/SS-B-Gens ............................108
6.8 Die codierende, C-terminale Nukleotidsequenz ...........................................................................108
6.9 Die alternativen Polyadenylierungsstellen ....................................................................................109
6.10 Die hot-spot-Region....................................................................................................................110
B) Analyse des murinen La/SS-B auf transkriptionaler und translationaler Ebene...............................111
6.11 Größenbestimmung der polyadenylierten mRNAs .....................................................................112
6.12 Suche nach weiteren mRNAs.....................................................................................................112
6.13 Ubiqitäre und zellspezifische Expression der mRNAs................................................................114
6.14 Fertig gesplissene und zytoplasmatische mRNAs .....................................................................117
6.15 Funktionelle mRNAs...................................................................................................................117
6.16 Der Translationsmechanismus der mRNAs ...............................................................................118
6.17 Die Lokalisation des Proteins .....................................................................................................126
C) Analyse des murinen La/SS-B auf Proteinebene .............................................................................126
6.18 Das murine La/SS-B-Protein ......................................................................................................127
6.18.1 Konservierungen...................................................................................................................127
6.18.2 Das RNP-Motiv .....................................................................................................................127
6.18.3 Das Kernlokalisationssignal ..................................................................................................127
6.18.4 Die linker-Region ..................................................................................................................128
6.18.5 Die ATP-Bindestelle..............................................................................................................128
6.19 Die isoelektrischen Proteinformen..............................................................................................129
6.20 Der Einfluß von NO auf das murine Autoantigen La/SS-B.........................................................130
6.20.1 Der Einfluß von NO auf die Expression ................................................................................132
6.20.2 Der Einfluß von NO auf die Lokalisation...............................................................................132
6.21 Induktion von ANAs durch Immunisierung des humanen La/SS-B-Neoepitops ........................133
6.21.1 epitope spreading induzierter ANAs......................................................................................133
6.21.2 Zellschädigende Vorläuferreaktion induzierter ANAs ...........................................................136
7 ZUSAMMENFASSUNG........................................................................................................................137
8 ANHANG ..............................................................................................................................................139
8.1 Genomische Sequenz des humanen La/SS-B.............................................................................139
8.2 Lage der Primer im murinen La/SS-B-Gen ..................................................................................141
8.3 Lage aller Oligonukleotide in der murinen La/SS-B-cDNA...........................................................143
9 ERKLÄRUNG ZUR DISSERTATION ...................................................................................................145
10 VERÖFFENTLICHUNGEN.................................................................................................................147
10.1 Gedruckte Vorträge ....................................................................................................................147
10.2 Vorträge......................................................................................................................................147