verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

4 Methoden 43
4.20 RT-PCR
Bei der RT-PCR wurde ein Teilstück einer spezifischen mRNA durch PCR amplifiziert. Dazu
wurde die mRNA durch reverse Transkription in cDNA umgeschrieben. Dies geschah entweder mit dem
nach stromaufwärts gerichteten Oligo(dT)-Primer, dessen Poly(dT)-Sequenz homolog zum Poly(A)-Trakt
von eukaryontischen mRNAs war, oder mit einem nach stromaufwärts gerichteten genspezifischen Primer
(GSP). Während der Oligo(dT)-Primer an den Poly(A)-Trakt aller mRNAs band, wurden mit dem GSP
bereits selektiv nur wenige mRNAs mit zu dem Primer homologen Sequenzen in cDNA umgeschrieben.
Bei der PCR wurde anschließend durch GSPs ein Teilbereich einer cDNA amplifiziert. Dazu musste
allerdings die Sequenz der cDNA bekannt sein. Die RT-PCR wurde nach dem Protokoll, der Methode und
den Reagenzien des SuperScript TM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis (3.5)
durchgeführt. Der RNA/Primer-Mix setzte sich aus 5 µg total-RNA, 1 µl Oligo(dT)-Primer und 2 µl GSP
bzw. 2 µl GSP1 zusammen. Dieser Ansatz wurde mit DEPC-H 2 O (aqua dest. mit 0,1% [v/v] DEPC) auf
12 µl aufgefüllt und für 10 min bei 70°C inkubiert, was eine Denaturierung der RNA zufolge hatte. Im
Anschluss daran folgte eine Inkubation für 1 min auf Eis und eine kurze Zentrifugation, um den Ansatz
wieder zu sammeln. Der Reaktionsmix mit einem Gesamtvolumen von 7 µl setzte sich aus 2 µl
10x PCR-Puffer, 2 µl MgCl 2 , 1 µl dNTPs und 2 µl DTT zusammen. Danach wurden 12 µl RNA/Primer-Mix
und 7 µl Reaktionsmix zusammenpipettiert, gevortext und kurz abzentrifugiert. Für die Anlagerung der
Primer an die RNA erfolgte eine Inkubation für 5 min bei 42°C. Schließlich wurde 1 µl SuperScript ΙΙ RT
zugegeben, danach gevortext und abzentrifugiert. Für die RT-Reaktion wurde der Ansatz für 60 min bei
42°C inkubiert. Im Anschluss wurde die Enzymsynthese durch Inkubation für 15 min bei 70°C terminiert.
Nach einer kurzen Abkühlung auf Eis konnte der Ansatz bei -20°C gelagert oder 10% des Ansatzes direkt
in der Amplifizierungs-PCR eingesetzt werden (4.18).
4.21 5’-RACE
Mit der 5’-RACE-Technik war es möglich, unbekannte 5’-Enden von mRNAs zu amplifizieren.
Dadurch konnten z.B. alternative 5’-Transkripte gefunden werden. In dieser Arbeit wurde das 5’-RACE
System (3.5) verwendet. Beim 5’-RACE ging die cDNA-Synthese durch RT-PCR immer von einem nach
stromaufwärts gerichteten GSP1 aus. An das 3’-Ende der cDNA (= das 5’-Ende der Ausgangs-mRNA)
wurde durch die terminale Desoxyribonukleotidyl-Transferase (TdT) ein Oligo(dC)-Trakt angefügt. Dieser
diente dem nach stromabwärts gerichteten Abridged Anchor Primer (AAP) als Bindestelle. Der AAP
bestand aus einer 3’-Region, welche komplementär zum Oligo(dC)-Trakt war, sowie einer
5’-Adaptersequenz. Mit dem AAP und dem GSP1 erfolgte eine erste Amplifizierung durch PCR, die aber
in der Regel nicht spezifisch genug war, so dass eine zweite Amplifizierung durch nested-PCR notwendig
war, mit der die Spezifität weiter erhöht wurde. Die zweite PCR erfolgte mit einem weiter stromaufwärts
vom GSP1 gelegenen nach stromaufwärts gerichteten GSP2 und dem Abridged Universal Amplification
Primer (AUAP), der an die 5’-Adaptersequenz des AAP band.
Durch die Reinigung des GSP1 war es möglich, diesen von Proteinen, z.B. RNasen, zu säubern,
da diese eine Durchführung des 5’-RACE unmöglich machen konnten. Um die Verluste an Nukleinsäuren
in der zu reinigenden Lösung in Grenzen zu halten, wurden 250 pmol des GSP1 auf 300 µl mit DEPC-H 2 O
(aqua dest. mit 0,1% [v/v] DEPC) aufgefüllt und durch Phenol/Chloroform-Extraktion gereinigt. Dazu