verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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4 Methoden
5000 g abzentrifugiert. Das Pellet konnte bei -70°C eingefroren werden. Das Pellet wurde mit demselben
Volumen an 1x PBS (0,8 mM Na 2 HPO 4 ; 0,1 mM KH 2 PO 4 ; 0,14 mM NaCl; 0,26 mM KCl; pH 7,4) für eine
Affinitätsreinigung (4.36) oder 95°C heißen 1x SDS-Probenpuffer (100 mM DTT; 10% [w/v] SDS; 50%
[v/v] Glycerin; 0,5% [w/v] Bromphenolblau; 50 mM Tris/HCl; pH 6,8) für eine SDS-PAGE (4.38)
aufgenommen und die Bakterien durch 6malige Exposition mit Ultraschallwellen für jeweils 30 sec mit
~100 W lysiert. Zwischenzeitlich wurde kurz auf Eis inkubiert, um einen Abbau der Proteine durch
Proteasen zu vermeiden. Zuletzt erfolgte eine 15minütige Zentrifugation mit 16000 g bei 4°C. Die
Proteinextrakte konnten bei -20°C gelagert werden.
4.36 Affinitätsreinigung von His-tag-Fusionsproteinen
Die Aufreinigung rek. His-tag-Fusionsproteine wurde mit einem von HOCHULI et al. (1987)
beschriebenen Säulenmaterial durchgeführt, bei dem ein Nitrilo-Essigsäure-(NTA)-Derivat (Ni-NTA-Säule)
mit vier funktionellen Gruppen als Ligand an Sepharose CL-6B gekoppelt vorlag. Die
Metallchelataffinitätschromatographie (MCAC) beruhte auf NTA als Metallchelatformer und dem zentral
gebundenen Ni 2+ , bei dem zwei der insgesamt sechs vorhandenen Koordinationsstellen des Ions frei
blieben, wodurch Proteine, die mehr als zwei benachbarte Histidin-Reste besaßen, binden konnten. Die
Bindekapazität wurde vom Hersteller mit 5-10 mg Protein pro ml Ni-NTA-Säule angegeben. Zur
Aufreinigung von His-tag-Fusionsproteinen besaß der pET28a-Vektor auf der 5’-Seite der MCS
Nukleotide, die für sechs aufeinanderfolgende Histidinreste (His-tag) codierten (HOCHULI et al., 1988).
Die Aufreinigung erolgte mit einem Niederdruck-Chromatographie-System, bestehend aus einer
Peristaltik-Pumpe, einem UV-Monitor und einem Schreiber. Der am Photometer angeschlossene
Schreiber zeichnete die Absorption der Flüssigkeit bei 254 nm auf. 1 ml der Ni-NTA-Säule wurde in
Fertigsäulen eingefüllt und diese mit Pumpe, Photometer und Auffanggefäß verbunden. Das Pumpsystem
bewirkte, dass soviel Flüssigkeit nachfloß, wie von der Säule zum Photometer gelangte. Bei einem
Austausch von einer zur anderen Lösung ließ man die Flüssigkeit gerade bis zur Harzoberfläche ablaufen.
So konnte eine Vermischung der Lösungen und ein Verdünnungseffekt vermieden werden. Die Matrix
durfte aber niemals austrocknen, da dies die Proteinbindungen zerstörte. Die Säule wurde mit 1x PBS
(0,8 mM Na 2 HPO 4 ; 0,1 mM KH 2 PO 4 ; 0,14 mM NaCl; 0,26 mM KCl; pH 7,4) äquilibiert und die Absorption
des Durchlaufs photometrisch erfasst. Es wurde solange äquilibrierte, bis der Schreiber eine gleichmäßige
Basislinie zeigte. Anschließend wurde der Proteinextrakt, 1:2 mit 1x PBS verdünnt, auf die Säule
gegeben. Dieser Vorgang wurde 2-3mal wiederholt, um die Proteinausbeute zu erhöhen. Anschließend
wurde die Säule mit 1x PBS gewaschen, bis der Schreiber wieder eine konstante Basislinie anzeigte.
Durch die niedrige Dissoziationskonstante von Ni-NTA (K D = 10 -13 bei pH 8,0) ließen sich unspezifisch
gebundene Proteine mit 10 mM Imidazol, einem Histidin-Analogon, von der Säule entfernen. Die Elution
der His-tag-Fusionsproteine erfolgte mit 150 mM Imidazol. Um das Imidazol, das beim Erhitzen Proteine
quervernetzen konnte, aus der affinitiätsgereinigten Proteinlösung zu entfernen, wurde das Eluat in einen
Dialyseschlauch gefüllt, der mindestens das doppelte Volumen des Eluates fassen sollte, um bei
eindiffundierender Flüssigkeit nicht zu platzen. Die Dialyse erfolgte über Nacht gegen zwei Liter 1x PBS
bei 4°C unter leichtem Rühren. Bei der SDS-PAGE wurden die Proben wegen des noch in geringen
Mengen vorhandenen Imidazols nur auf 56°C erhitzt. Die Proteine konnten bei -20°C gelagert werden.