verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

5 Ergebnisse 83
Laufspur 2 ein HeLa-Zellextrakt aufgetragen (Abb. 15).
In Laufspur 3 (Abb. 15) wurde ein Extrakt aus mit pCI-CAT transfizierten HeLa-Zellen
aufgetragen. Hierbei konnte das endogene, humane La/SS-B-Protein bei etwa 50 kDa (obere
Bande) und das CAT-Protein mit einem MW von ca. 29 kDa (untere Bande) detektiert werden.
In Laufspur 4 (Abb. 15) mit pCI-CAT-La-Murin (Exon 2-11) transfizierten HeLa-Zellen,
konnten nur das endogene, humane La/SS-B-Protein und das CAT-Protein nachgewiesen
werden, nicht aber das murine La/SS-B-Protein. Die Expression des zweiten Leserahmens
(murines La/SS-B) hätte nur möglich sein können, wenn IRES-Elemente innerhalb des
codierenden La/SS-B-Leserahmens lagen. Da die Translation nicht durch Exon 1-spezifische
5’-Strukturen beeinflusst werden konnte, konnten sich potentielle IRES-Elemente nur noch in
den verschiedenen 5’-UTRs der murinen La/SS-B-cDNAs befinden.
In den Laufspuren 5-7 (Abb. 15) konnte das endogene humane La/SS-B-Protein (obere
Bande) und und das CAT-Protein als Translationsprodukt des ersten Leserahmens (untere
Bande) detektiert werden. Das murine La/SS-B-Protein mit einem MW von etwa 45 kDa ließ
sich als Translationsprodukt des zweiten Leserahmens in keinem Fall detektiert (Abb. 15).
Somit enthielten die verschiedenen 5’-UTRs der murinen La/SS-B-cDNAs nicht die Information,
die für eine interne Translationsinitiation verantwortlich waren.
Das CAT-Protein konnte im Vergleich zum endogenen, humanen La/SS-B-Protein in
allen transfizierten HeLa-Zellextrakten in höherer Konzentration detektiert werden (Abb. 15),
was für eine gut gelungene Transfektion gewertet werden konnte.
Zusammengefasst ließ sich folgendes feststellen: In allen dicistronen Konstrukten wurde
nur der erste der beide Leserahmen (CAT-Leserahmen) exprimiert. In keinem Fall wurde das
zweite, für La/SS-B codierende Cistron, translatiert. Dies ließ den Schluß zu, dass die murinen
La/SS-B-cDNAs keine IRES besaßen und die Translation nicht durch interne
Translationsinitiation am Start-AUG im Exon 2 erfolgte.
Abb. 15: Immuno-Blot zur Untersuchung einer IRES nach transienter Transfektion der drei
murinen 5’-cDNA-Isoformen humaner HeLa-Zellen
Als Marker wurde der LMW-Marker (3.16) verwendet.
1) NIH-3T3-Zellextrakt; 2) HeLa-Zellextrakt; 3) pCI-CAT ; 4) pCI-CAT-La-Murin (Exon 2-Exon 11) ;
5) pCI-CAT-Maus-La-Ex1a ; 6) pCI-CAT-Maus-La-Ex1b; 7) pCI-CAT-Maus-La-Ex1c