verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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6 Diskussion
Translationsinitiation erfolgen sollte (BACHMANN et al., 2000). Nach der Hypothese von YOO
und WOLIN (1997) könnte das La/SS-B-Protein durch seine chaperone-Aktivität die Menge an
korrekt gefalteten RNAs und damit die Funktionalität der IRES erhöhen. So konnte die Menge
der Polio-Virus-RNA durch die Zugabe von rek. La/SS-B-Protein zu Reticulozyten-Lysat auf das
10fache gesteigert werden (MEEROVITCH et al., 1993).
Nach JACKSON et al. (1995) gab es nur einen überzeugenden Nachweis für die
Existenz einer IRES: den dicistronen-mRNA-Test. Bei einer dicistronen mRNA lagen zwei
vollständige, offene Leserahmen (Cistrons) mit einer 5’-UTR, einem Initiator-AUG und einem
Stop-Codon auf einer mRNA direkt hintereinander. Da beide Sequenzen unter der Kontrolle
eines übergeordneten Promotors standen, wurden sie bei der Transkription in eine dicistrone
mRNA umgeschrieben. An die 5’-Kappe dieser dicistronen mRNA band die 40S-Untereinheit
des Ribosoms und wanderte von dort aus stromabwärts, bis sie ein in einer optimalen
Umgebung liegendes Start-AUG erreicht hatte. Dort verband sie sich mit der
60S-Ribosomenuntereinheit und die Translation begann. Wenn das Ribosom an dem ersten
Stop-Codon angelangt war, das in einem dicistronen Konstrukt das des ersten Leserahmens
sein sollte, zerfiel es in seine Untereinheiten und beendete damit die Übersetzung der mRNA in
eine Proteinsequenz. Normalerweise sollte in einer eukaryontischen Zelle lediglich das erste
Cistron translatiert werden. Ein darunterliegender Leserahmen konnte nur dann noch
translatiert werden, wenn er eine IRES enthielt, an der das Ribosom intern initiieren konnte. Die
Hypothese wurde untermauert, wenn die Translationseffizienz des zweiten Cistrons gegenüber
der des ersten nicht stark vermindert war (KAMINSKI et al., 1994). PELLETIER und
SONENBERG (1988) plazierten die 5’-UTR des Polio-Virus zwischen die Leserahmen für die
Thymidin-Kinase und die Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT). Die Autoren konnten
nachweisen, dass sowohl in vivo nach Transfektion in Cos-Zellen als auch in vitro in einem
Reticulozyten-Translationssystem das zweite Cistron der dicistronen mRNA translatiert wurde.
Die Situation der Translation von zwei der humanen La/SS-B-mRNA-Isoformen ließ sich
mit den Modellen zur Initiation der Translation bei Vertebraten nur schwer in Einklang bringen.
Die klassische Exon 1-La/SS-B-mRNA-Isoform enthielt keine weiteren AUGs, besaß keine
besonderen Strukturmerkmale, entsprach mit etwa 100 Nukleotiden Länge den Kriterien einer
gut scannbaren mRNA und wurde von einem Promotor transkribiert, wie er typisch für
Haushaltsgene war (GRÖLZ, 1998) (1.5.3). Diese mRNA-Isoform sollte demnach gut
translatierbar sein, keine IRES besitzen und daher auch nicht nach dem Mechanismus der
internen Initiation translatiert werden müssten. Dagegen besaßen die alternativen Exon 1’- bzw.
Exon 1’’-La/SS-B-mRNAs eine etwa 500 Nukleotide lange 5’-UTR mit ausgedehnten
Sekundärstrukturen und drei zusätzlichen AUGs mit offenen Leserahmen (ORF-1 bis 3) (1.5.3).
Aus diesen Gründen erschienen die beiden alternativen mRNAs nach dem scanning-Modell für
eine Translation ungeeignet. Die Untersuchung und der Nachweis einer IRES bei den humanen
La/SS-B-mRNA-Isoformen erfolgte mit dem dicistronen-mRNA-Test. Alle verwendeten
Konstrukte enthielten als ersten Leserahmen den der Chloramphenicol-Acetyltransferase und