verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

4 Methoden 35
4.8 Saure, ethanolische Fällung von Nukleinsäuren
Durch die saure, ethanolische Fällungen von Nukleinsäuren nach SAMBROOK et al. (1989)
erfolgte ein Abtrennung von Proteinen und Pufferbestandteilen und eine Konzentrierung der
Nukleinsäuren. Die Nukleinsäure-Lösung wurde mit 1/10 Volumen einer 3 M NaOAc-Lösung (pH 7,0)
sowie dem 2,5fachen Ursprungsvolumen Ethanol p.a. versetzt. Gefällt wurde für 30 min bei -70°C bzw.
über Nacht bei -20°C. Nach einer 30minütigen Zentrifugation mit 16000 g bei 4°C wurde der Überstand
dekantiert. Zur Entfernung mitgefällter Salze wurde das Pellet 2mal mit dem 1,5 fachen Volumen des
ursprünglichen Fällungsvolumens mit 70%igem Ethanol gewaschen. Der Ansatz wurde für 10 min bei 4°C
mit 16000 g zentrifugiert, der Überstand dekantiert, das Pellet bei 37°C getrocknet und schließlich in 10
bis 40 µl TE (10 mM Tris/HCl; 1 mM EDTA; pH 7,3-8,3) oder aqua dest. aufgenommen.
4.9 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren
Die Agarosegelelektrophorese diente dazu, Nukleinsäuren nach ihrer Größe und Konformation zu
trennen und durch Anfärben sichtbar zu machen. Nukleinsäuren waren Makromoleküle, die bei
physiologischem pH-Wert eine negative Gesamtladung besaßen und sich daher im elektrischen Feld zur
Anode hin bewegten. Agarose bestand aus einem Gemisch saurer, linearer und gelierfähiger
Polysaccharide. Die Wanderungsrate linearer Nukleinsäuren in einem Agarosegel verhielt sich umgekehrt
proportional zum Logarithmus ihres MW (SAMBROOK et al., 1989). Die Wanderungsgeschwindigkeit
hing, infolge der Bildung eines Molekularsiebes, von der Konzentration der Agarose im Gel ab. Nach
AUSUBEL et al. (1987) konnte mit einer Agarosekonzentration von 1% [w/v] ein Auftrennungsbereich
linearer Nukleinsäuren zwischen 10 und 0,5 kb erreicht werden. Weitere Parameter, die die
Wanderungsgeschwindigkeit beeinflussten, waren die Pufferbedingungen und die Konformation. So liefen
z.B. spiralisierte (supercoiled) Nukleinsäuren im Vergleich zu linearen auf etwa zwei Drittel der von der
Basenzahl her zu erwartenden Höhe, da das Molekül durch die Verdrillung kleiner und kompakter war und
sich somit schneller durch das Gel bewegten. Offene, relaxierte, zirkuläre (nicked circle) Nukleinsäuren
wanderte dagegen weit langsamer.
4.9.1 DNA-Agarosegele
Als Form für die Gele dienten mit Klebeband umrandete Glasplatten. Der Probenkamm wurde am
oberen Rand mit einem Abstand von ca. 1 mm zur Platte in die Form eingesetzt. 1 bis 2% [w/v] Agarose
wurde mit 1x TAE-Elektrophoresepuffer (40 mM TrisOAc; 1 mM EDTA; pH 8,0) aufgekocht, bis die
Lösung klar erschien und in die vorgefertigte Form gegossen. Dabei sollte die Höhe des Gels ca. 0,5 cm
betragen. Für die Elektrophorese von DNA-Fragmenten, die aus dem Gel eluiert werden sollten, und für
die Analyse sehr kleiner und eng beieinander liegender DNA-Fragmente wurden die Gele aus
LMP-Agarose hergestellt. Diese Agarose war reiner als herkömmliche Agarose und schmolz bei
niedrigerer Temperatur (LMP-Agarose: 60°C; normale Agarose: 90°C). Die einzelnen Banden erscheinen
im Gel schärfer voneinander abgetrennt und waren weniger mit anderen DNA-Fragmenten verunreinigt.