verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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4 Methoden
wurde die Lösung mit demselben Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1) versetzt und kurz
auf dem Vortexschüttler homogenisiert, bis eine milchige Suspension entstanden war. 10 min
Zentrifugation bei 16000 g trennten das Gemisch in eine wäßrige, obere Phase, eine dünne Interphase
und eine hydrophobe, untere Phase. Die wäßrige Phase wurde vorsichtig abgesaugt und zur Entfernung
von Phenolresten erneut mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) ausgeschüttelt, zentrifugiert und
abgesaugt. Im Anschluss daran wurde der wäßrige Überstand aus der Chloroform-Extraktion durch saure
ethanolische Fällung gefällt und das Pellet in 100 µl DEPC-H 2 O aufgenommen.
Die cDNA-Synthese erfolgte wie unter 4.20 beschrieben mit 2,5 pmol gereinigtem GSP1. Um
überschüssige GSP1, Puffer-Komponenten, dNTPs und Enzyme zu entfernen, wurde die cDNA
anschließend einer Reinigung unterzogen. Diese Reinigung erfolgte durch die Bindung der DNA an die
Silica-Matrix einer Säule in Gegenwart des chaotropen Salzes Natriumjodid (VOGELSTEIN und
GILLESPIE, 1979). Zum cDNA-Reaktionsgemisch wurden 90 µl (4,5faches Volumen) der Binde-Lösung
zugefügt und die Lösung auf eine GlassMax-Spin-Säule aufgetragen. Nach 30 sec Zentrifugation bei
16000 g war die cDNA an die Silica-Matrix der Säule gebunden. Gewaschen wurde durch Auftragen und
30sekündiger Zentrifugation bei 16000 g mit 3mal 400 µl eiskaltem 1x Waschpuffer und anschließend
2mal mit 400 µl eiskaltem 70%igem Ethanol. Nach Entfernung des Ethanols wurde nochmals für 1 min
zentrifugiert und die cDNA schließlich mit 50 µl 65°C warmen DEPC-H 2 O von der Säule eluiert.
In ein Reaktionsgefäß wurden 10 µl der gereinigten cDNA, 5 µl 5x Tailing-Puffer und 2,5 µl dCTPs
pipettiert, für 3 min bei 94°C inkubiert und 1 min auf Eis gestellt. Der Inhalt des Gefäßes wurde kurz
herunterzentrifugiert, 1 µl TdT zugefügt und für 10 min bei 37°C inkubiert. Die TdT wurde zum Schluß
durch Erhitzen für 10 min auf 70°C inaktiviert. Die mit einem Oligo(dC)-Trakt versehene cDNA konnte bei
-20°C aufbewahrt oder direkt für die Amplifikation der cDNA eingesetzt werden.
Für die erste Amplifizierung wurden in einem 50 µl-PCR-Ansatz 4 µl cDNA, 1 µl AAP-Primer und
2 µl GSP1 verwendet. Die erhaltenen PCR-Produkte wurden mit aqua dest. 1:100 verdünnt und davon
5 µl für eine zweite Amplifizierung (nested-PCR) mit 1 µl AUAP-Primer und 2 µl GSP2 eingesetzt.
4.22 Genome walking
Das genome walking war ein Verfahren zur Amplifizierung eines Teilstücks einer genomischen
DNA-Sequenz durch PCR. In dieser Arbeit wurde das GenomeWalker-Kit (3.5) zur Amplifizierung
unbekannter 5’-Enden von genomischer DNA verwendet. Genomische DNA war jeweils mit fünf
verschiedenen blunt-end-Restriktionsenzymen (EcoR V, Sca I, Dra I, Pvu II, Ssp I) verdaut und an deren
5’-Ende ein DNA-Adapter bekannter Sequenz angefügt worden, der als Anker für einen ersten
Adapter-Primer (AP1) fungierte. Ein nach stromaufwärts gerichteter genspezifische Primer (GSP1) diente
als Rückwärtsprimer. Während der Adapter-Primer im Verlauf der PCR an die Adaptersequenz aller
DNAs band, wurden mit dem GSP1 bereits selektiv nur wenige DNAs mit zu dem Primer homologen
Sequenzen amplifiziert. Bei der sich anschließenden nested-PCR wurde durch den zweiten
Adapter-Primer (AP2) und den weiter innen liegenden zweiten genspezifischen Primer (GSP2;
nested-Primer) die Spezifität soweit erhöht, dass der gewünschte DNA-Bereich aus dem DNA-Gemisch
amplifiziert wurde. Abweichend vom Protokoll des Herstellers wurde eine Drei-Schritt-PCR mit der
Taq-Polymerase durchgeführt. Für eine genome walking-PCR wurde 1 µg DNA als Vorlage eingesetzt.