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130 6 Diskussion und rek. Proteinen (pI zwischen 4,5 und 5.5) ließ sich eine pI-Wert-Verschiebung in den sauren Bereich feststellen. Dies war sicherlich auf die unterschiedliche Art der Gewinnung dieser beiden Proben zurückzuführen (5.10). Somit war es nicht möglich, die einzelnen isoelektrischen Formen der Zellextrakt-La/SS-B-Proteine und der rek. La/SS-B-Proteine zu vergleichen und dadurch festzustellem, welche isoelektrische Form der entsprechenden zuzuordnen war. Da für das murine La/SS-B-Proteine 16 isoelektrische Formen detektiert werden konnten, sollte überprüft werden, ob noch weitere humane isoelektrische Proteinformen des La/SS-B existierten (5.10). Und tatsächlich konnte mit der hochauflösenden 2D-Gelelektrophorese mit humanem HeLa-Zellextrakt insgesamt 16 isoelektrische La/SS-B-Proteinformen mit einem pI zwischen 6,0 und 6,8 detektiert werden (5.10). Nun stellte sich Frage, warum zwei Proteinformen mehr detektiert werden konnten. Die erste Möglichkeit bestand darin, dass von den Autoren über den mAK SW5 aufgereinigte, humane Zellextrakte verwendet wurden. Zellextraktaufarbeitungen konnten stark die isoelektrische Fokussierung (1. Dimension) beeinflussen. Jede zusätzliche Behandlung eines Extraktes konnte zu Modifikationen von Proteinen führen. Zum zweiten könnten die verwendeten mAK die Ursache für die Diskrepanz darstellen. Der hier verwendete mAK 5B9 könnte ein solches Epitop im La/SS-B-Protein erkennen, dass es ihm möglich war, alle isoelektrischen Proteinformen zu erkennen. Vielleicht lag das Epitop des von BROEKHUIS et al. (2000) verwendeten mAK SW5 in einer Region des La/SS-B-Proteins, die einer solchen Modifikation unterworfen war, dass dieser mAK eine solche isoelektrische Proteinform nicht mehr detektieren konnte. Des weiteren ließen sich geringe Unterschiede in den erhaltenen pI-Werten feststellen. Im Folgenden sollten hier die Ergebnisse zusammengefasst werden: BROEKHUIS et al. (2000) detektierten 14 isoelektrischen Formen des humanen La/SS-B-Proteins mit einem pI zwischen 6 und 7,5. In dieser Arbeit wurden 16 isoelektrischen Formen des humanen La/SS-B-Proteins mit einem pI von 6 und 6,8 nachgewiesen. Dieser Unterschied könnte die Theorie stützen, dass Zellextraktaufarbeitungen die isoelektrische Fokussierung (1. Dimension) beeinflussen könnten. Eine 2D-Gelelektrophorese mit murinem NIH-3T3-Zellextrakt lieferte ebenfalls 16 isoelektrische Proteinformen mit einem pI zwischen 5,1 und 6,1. Rek. murines La/SS-B-Protein lieferte 13 isoelektrische Proteinformen mit einem pI zwischen 4,5 und 5,5. Das murine La/SS-B-Protein besaß somit eine hohe Ladungsheterogenität. Der Unterschied von drei isoelektrischen, Proteinformen korrelierte mit den drei potentiellen Phosphorylierungsstellen im murinen La/SS-B-Protein. 6.20 Der Einfluß von NO auf das murine Autoantigen La/SS-B Die Rolle von NO in Säugern war sehr komplex. Alleine die Tatsache, dass ein so einfach aufgebautes Molekül Signalfunktionen ausübte und dadurch komplexe Prozesse steuerte, war höchst erstaunlich (BOGDAN, 1998). Mittlerweile wurden drei verschiedene
6 Diskussion 131 NO-Synthasen (NOS) beschrieben, die alle die gleiche Redoxreaktion katalysierten, sich jedoch in ihren biochemischen und strukturellen Eigenschaften, in der Art und Weise der NO-Freisetzung, in ihrer Verteilung und in ihrer Regulation beträchtlich voneinander unterschieden (MICHEL und FERON, 1997; NATHAN, 1997). Die Typ 1-NOS wurde konstitutiv in Neuronen exprimiert, deren Aktivität durch den Ca 2+ -Gradienten reguliert wurde. NO war in Neuronen wichtig für die Neurotransmission und den Lernvorgang. Die Typ 2-NOS wurde auf transkriptionaler Ebene durch Zytokine induziert. Eine Regulation durch einen Ca 2+ -Gradienten fand nicht statt. Exprimiert wurde die Typ 2-NOS vor allem in inflammatorisch wirkenden Makrophagen, denen es dadurch möglich war mikrobielle Pathogene und Tumorzellen effektiv zu bekämpfen. Die Typ 3-NOS wurde konstitutiv in Endothel- und Blutzellen exprimiert. NO regulierte dort den Tonus der glatten Endothelmuskulatur, die Thrombozytenaggregation und die Adhäsion von zirkulierenden Blutzellen an die Endothelzellen. In jüngerer Zeit hatte sich gezeigt, dass nicht nur die Zytokin-induzierbare Typ 2-NOS, sondern auch die konstitutive Typ 1-NOS und Typ 3-NOS in ihrer Expression reguliert werden konnten. In Anbetracht der zahlreichen Funktionen der NOS kam der Expressionsregulation dieser Enzyme erhebliche physiologische und pathophysiologische Bedeutung zu (BOGDAN, 1998). NO schützte vor intrazellulären Bakterien und Parasiten und half bei der Bekämpfung von verschiedenen viralen Infektionen (XIE et al., 1996; BOGDAN, 1997; MACMICKING et al., 1997; FANG, 1997), förderte aber die Entstehung von Tumoren und Metastasen (JENKINS et al., 1995; DUENAS-GONZALEZ et al., 1997). NO besaß auch neurotoxische Eigenschaften und konnte Bluthochdruck verursachen (MICHEL und FERON, 1997; NATHAN, 1997). Außerdem konnte in Tiermodellen von Nagern eindrucksvoll bestätigt werden, dass NO die experimentelle, allergische Encephalopathie und Uveitis, die inflammatorische Arthritis und die Immunkomplex-Glomerulonephritis auslöste (MCCARTNEY-FRANCIS et al., 1993; WEINBERG et al., 1994; CROSS et al., 1994; ZHAO et al., 1996; BRENNER et al., 1997; HOEY et al., 1997). Somit hatte NO einen entscheidenden Einfluß bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen. Hierbei beeinflusste NO das Verhältnis der Th1/Th2-CD4-T-Zellen, wodurch sich das Verhältnis der Th1/Th2-spezifischen Zytokine änderte (SINGH et al., 2000). Bei SLE-Patienten konnte eine Hochregulation der induzierbaren Typ 2-NOS im Gefäßendothel und eine insgesamt erhöhte Blut-NO-Konzentration festgestellt werden (BELMONT et al., 1997). Diese Ergebnisse für das Gefäßendothel konnten von BRUNDIN et al. (1998) im Gehirn von SLE-Patienten bestätigt werden, wobei die NO-Konzentration ebenfalls erhöht war. Eine generelle Erhöhung der NO-Konzentration bei SLE-Patienten konnten WANCHU et al. (1998) feststellen. Dies ließ den Schluß zu, dass NO einen wichtiger Faktor für die Entstehung von SLE darstellen könnte. Die Frage blieb aber bestehen, ob die erhöhte NO-Konzentration die Entstehung von Autoimmunität auslöste oder ob die erhöhte NO-Konzentration eine Folge von Autoimmunität war. Nicht auszuschließen war auch ein möglicher gegenseitiger Verstärkereffekt. Die pathophysiologische Funktion von NO konnte nur vollständig geklärt werden, wenn
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