verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

4 Methoden 45
4.23 Zu beachtende Arbeitsbedingungen bei Arbeiten mit RNA
Bei Arbeiten mit RNA bestand die Gefahr der Kontamination mit RNasen. Aus diesem Grund
wurde stets mit Handschuhen, hitzesterilisierten Glasgefäßen und RNase-freien Einwegartikeln
gearbeitet. Zur Zerstörung der ubiquitär vorkommenden RNasen reichte eine Autoklavierung nicht aus, da
sich die denaturierten Proteine spontan wieder zurückfalten konnten. Ein wirksamer Inhibitor von RNasen
war DEPC, das kovalent an Histidin- und Tyrosin-Reste in Proteinen band und dadurch ihre Struktur
zerstörte (LENONARD et al., 1970). Reaktionsgefäße und Pipettenspitzen, welche mit RNA-haltigen
Lösungen in Berührung kommen sollten, wurden über Nacht in DEPC-H 2 O (aqua dest. mit 0,1% [v/v]
DEPC) gelegt, 30 min autoklaviert und getrocknet. Alle benötigten Lösungen wurden mit 0,1% [v/v] DEPC
angesetzt. Um einen autokatalytischen Prozeß der RNA zu verhindern, wurde stets auf Eis gearbeitet.
Auch SDS war in wirksamer RNase-Inhibitor. Elektrophoresekammern, Gelformen, etc. wurden über
Nacht in eine 1%ige SDS-Lösung gelegt und anschließend mit Isopropanol und DEPC-H 2 O gespült.
4.24 RNA-Isolierung aus Zellkulturen und Geweben
Die schnelle Isolierung von RNA aus Zellkulturen oder Geweben erfolgte durch
Phenol/Chloroform-Extraktion nach dem Protokoll von CHOMCZYNSKI und SACCHI (1987).
Für eine RNA-Präparation aus Zellen wurden diese in Petrischalen (∅ 6,5 cm) ausgesät (4.27).
Die Zellen wuchsen bis zur gewünschten Konfluenz heran. Das Kulturmedium wurde entfernt und die
Zellen 2mal mit kaltem 1x PBS (0,8 mM Na 2 HPO 4 ; 0,1 mM KH 2 PO 4 ; 0,14 mM NaCl; 0,26 mM KCl; pH 7,4)
gespült, um das Kulturmedium zu entfernen. Schließlich wurden 400 µl einer kalten GSCN-Lösung (4,3 M
Guanidinthiocyanat; 17 mM N-Lauroylsarcosin; 0,7% [v/v] ß-Mercaptoethanol; 0,75 mM Na-Citrat; pH 7,0)
auf die Schale gegeben, die Zellen homogenisiert und in ein Reaktionsgefäß überführt.
Für die mRNA-Präparation aus Geweben wurden Balb/c-Mäuse verwendet. Zur
Gewebeentnahme wurden die Tiere mit Kohlendioxid betäubt und anschließend durch Genickbruch
getötet. Die Präparation der Gewebe erfolgte auf Eis, um die Aktivität von Enzymen, speziell RNasen, zu
minimieren. Das Präparationsbesteck wurde vorher durch Hitzesterilisation von RNasen befreit. DieTiere
wurden eröffnet, die gewünschten Organe entnommen, kurz in kaltem, sterilem 1x PBS gespült und
schließlich in auf 4°C vorgekühlte Reaktionsgefäße überführt. Dazu wurde dasselbe Volumen an kalter
GSCN-Lösung gegeben. Die Röhrchen wurden mehrmals einem Einfrier-Auftauvorgang (Wechsel
zwischen flüssigem Stickstoff und RT) unterzogen, um die Zellen zu lysieren. Oft war es nötig, gleiche
Gewebe aus mehreren Mäusen zu vereinen, um eine höhere RNA-Ausbeute zu erhalten.
Den in GSCN-Lösung lysierten Zellkulturen bzw. Geweben wurde jeweils 1/10 Volumen einer 2 M
NaOAc-Lösung (pH 4,0), 400 µl Phenol und 120 µl Chloroform zugeben. Die Suspension wurde durch
vortexen gründlich gemischt, bis eine milchige Suspension entstanden war. Nach einer 15minütigen
Inkubation auf Eis folgte eine Zentrifugation für 15 min bei 4°C mit 16000 g, die das Gemisch in eine
RNA-haltige, wäßrige, obere Phase, eine dünne Interphase und eine hydrophobe, untere Phase
auftrennte. Die RNA-haltige Phase wurde abgesaugt und in neues Reaktionsgefäß überführt. Schließlich
wurde die RNA nach Zugabe von 700 µl kaltem Ispropanol 1 h bei -70°C oder über Nacht bei -20°C
gefällt. Im Anschluss daran wurde die RNA durch eine 30minütige Zentrifugation mit 16000 g bei 4°C
pelletiert und das Pellet zuerst mit 70% Ethanol, dann mit 96% Ethanol gewaschen. Das Ethanol wurde