verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

5 Ergebnisse 75
La-Murin-RT-PCR-Rück (3.20) ein PCR-Fragment des La/SS-B amplifiziert, das am 5’-Ende mit
dem Start-AUG im Exon 2 begann und am 3’-Ende mit dem Stop-Codon endete und somit nur
den codierenden Leserahmen enthielt. Somit konnte die Translation nicht durch
Exon 1-spezifische 5’-Strukturen beeinflusst werden. Die cDNA wurde durch T/A-Klonierung in
den Vektor pGEM-T (3.10) einkloniert.
Für die weitere Klonierung dieser vier cDNAs in den eukaryontischen Expressionsvektor
pcDNA3 (3.10) besaßen alle verwendeten Vorwärtsprimer an ihrem 5’-Ende artifizielle
EcoR I-Restriktionsschnittstellen und alle Rückwärtsprimer an ihrem 3’-Ende artifizielle
Not I-Restriktionsschnittstellen. Dadurch konnten alle cDNAs durch einen Restriktionsverdau
(4.13) mit den Enzymen EcoR I und Not I (3.4) aus dem PCR-Klonierungsvektor pGEM-T
herausgeschnitten und in den Vektor pcDNA3 einkloniert werden, der ebenfalls mit den
Enzymen EcoR I und Not I verdaut wurde. Die durch diese Klonierung entstandenen Konstrukte
wurden wie folgt bezeichnet: pcDNA3-Maus-La-Ex1a, pcDNA3-Maus-La-Ex1b,
pcDNA3-Maus-La-Ex1c und pcDNA3-La-Murin (Exon 2-11).
Nach Abschluß der Klonierungen wurden alle Bereiche, die durch PCR amplifiziert
worden waren, sowie die Klonierungsschnittstellen und Übergänge vom Vektor zur cDNA durch
Sequenzierung (4.17) auf Mutationen oder Klonierungsartefakte hin untersucht.
5.5.2 Transiente Transfektion
Die Translationsfähigkeit der drei murinen La/SS-B-cDNA-Isoformen (5.5.1) wurde mit
der Technik der transienten Transfektion untersucht. Die Expressionsanalyse wurde in der
humanen Zelllinien HeLa (3.8) durchgeführt. Das Zellsystem musste die Voraussetzung
erfüllen, dass das durch die hineintransfizierten cDNAs exprimierte murine La/SS-B-Protein
vom endogenen, humanen La/SS-B-Protein im Immuno-Blot unterscheidbar war.
Für die Untersuchung der Expression im Immuno-Blot wurden humane HeLa-Zellen
(3.8) mit den Vektoren, die unter 5.5.1 kloniert worden waren (pcDNA3-La-Murin (Exon 2-11),
pcDNA3-Maus-La-Ex1a, pcDNA3-Maus-La-Ex1b und pcDNA3-Maus-La-Ex1c) transient
transfiziert (4.31). Dabei diente das Konstrukt pcDNA3-La-Murin (Exon 2-11) als
Positiv-Kontrolle. Zusätzlich wurde als Negativ-Kontrolle der Vektor pcDNA3 transfiziert. Von
den Zellen wurden Zellextrakte hergestellt (4.29), in einem 10 %igen SDS-Gel durch
Elektrophorese (4.38) aufgetrennt und durch das Western-Blotting auf eine Trägermembran
übertragen (4.40). Die Probenvolumina betrugen jeweils 20 µl. Für die Detektion der
La/SS-B-Proteine wurde der Immuno-Blot mit dem primären mAK 5B9 (3.12) und dem
AP-markierten Sekundär-AK anti-Maus-IgG (3.13) im NBT-X-Phosphat-System (4.42) gefärbt.
Kreuzreaktivitäten zwischen den AK konnten ausgeschlossen werden, wie Laborerfahrungen
gezeigt hatten. Der mAK 5B9 reagierte gleichermaßen mit murinem und humanem
La/SS-B-Protein (DRATHEN, 1997). Der Immuno-Blot ist in Abb. 10 dargestellt.