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6 Diskussion
6.13 Ubiqitäre und zellspezifische Expression der mRNAs
Die Expression der drei murinen La/SS-B-mRNA-Isoformen in Mausgeweben,
Mausembryonen, murinen Zellkulturen und Primärzellen sollte dahingehend untersucht werden,
ob eine gewebespezifische mRNA-Expression festzustellen war (5.4). Voraussetzung für
diesen Versuch war, dass sich durch die angewandte Methode alle drei murinen
La/SS-B-mRNA-Isoformen eindeutig voneinander unterscheiden ließen, dass die Methode
einfach, schnell und reproduzierbar war, dass wenig Ausgangsmaterial notwendig war, dass die
Methode sensitiv genug war und dass eventuell eine Quantifizierung möglich war.
Zu dieser Untersuchung boten sich somit die Methode des Northern-Blots, der
in situ-Hybridisierung oder der RT-PCR an. Das Northern-Blotting bot z.B. die Möglichkeit, die
La/SS-B-mRNA-Isoformen relativ schnell und mit geringem Aufwand zu quantifizieren.
Allerdings war eine Unterscheidung der mRNA-Isoformen auf Grund des geringen
Auflösungsvermögens der mRNAs bei einer Laufhöhe von ca. 1,8 kb nicht möglich (5.2). Des
weiteren erforderte das Northern-Blotting große Mengen an Ausgangsmaterial. So benötigten
CHAMBERS et al. (1988) für einen Northern-Blot 10 µg Poly(A)-gereinigter humaner
La/SS-B-mRNA. Diese Menge an gereinigter mRNA erforderte ungefähr 1 mg RNA einer
Präparation von total-RNA. Ein Northern-Blot konnte aus diesem Grunde nur angewendet
werden, wenn genügend Ausgangsmaterial zur Verfügung stand und das Gen von Interesse in
größerem Ausmaß exprimiert wurde. In der in situ-Hybridisierung war es zwar möglich, die drei
murinen La/SS-B-mRNA-Isoformen eindeutig voneinander zu unterscheiden (5.3), jedoch
gestaltete sich die Herstellung von Gewebeschnitten gerade bei sehr kleinen Geweben (z.B.
Nebenniere) als schwierig. Auch war die in situ-Hybridisierung oft weniger gut zu reproduzieren.
Die RT-PCR stellte eine der sensitivsten Techniken dar. Ausgehend von Femtogramm
oder nur einem einzelnen Molekül wurde die Nukleinsäure zwischen zwei Primern um das
10 7 -10 10 fache vermehrt. Daher waren nur geringe Mengen an Ausgangsmaterial notwenig.
Theoretisch wurden in der PCR während der exponentiellen Phase der Vermehrung in n Zyklen
2 n Kopien des PCR-Produktes gebildet. Tatsächlich war die Vermehrungsrate zumeist geringer
und hing von einer Vielzahl von Parametern wie z.B. den Reaktionsbedingungen und
Bindungseigenschaften der Primer ab. Im Vergleich zum Northern-Blotting wurde für einen
Ansatz einer RT-PCR nur etwa 5 µg total-RNA eingesetzt. Außerdem konnten gleiche Gewebe
vereinigt werden. Ein Nachteil der RT-PCR war, dass sich die PCR-Produkte nur sehr schwer
quantifizieren ließen. Die bisher übliche Methode mit einer Referenz-RNA und das Austesten
der optimalen Zyklenzahl war in dieser Art und Weise nicht mehr akzeptiert. Heute erfolgte eine
PCR-Quantifizierung mit einem light-cycler, der die Zunahme der PCR-Produkte während der
PCR photometrisch bestimmte. Ein solches Gerät stand allerdings nicht zur Verfügung.
Voraussetzung für eine Quantifizierung war des weiteren, dass die Referenz-mRNA und die zu
untersuchende mRNA im gleichen Ansatz amplifiziert wurden, was wahrscheinlich nicht möglich
war, da eine Hybridisierung der Primer mit sich selbst nicht auszuschließen war. Nach