verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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den verschiedenen La/SS-B-cDNAs kloniert werden konnte (Abb. 14).
Zusätzlich sollte ein pCI-Konstrukt kloniert werden, das nur den CAT-Leserahmen
enthielt. Dazu wurde der Vektor pCI mit den Restriktionsenzymen Nhe I und Xho I verdaut und
die CAT-cDNA einkloniert, die ebenfalls mit den Restriktionsenzymen Nhe I und Xho I verdaut
worden war. Das dabei entstandene Konstrukt erhielt die Bezeichnung pCI-CAT.
Am Ende der Klonierungen standen folgende Konstrukte zur transienten Transfektion in
HeLa-Zellen (5.7.2) zur Verfügung: pCI-CAT-Ex1a-Maus-La, pCI-CAT-Ex1b-Maus-La,
pCI-CAT-Ex1c-Maus-La, pCI-CAT-La-Murin (Exon 2-11) und pCI-CAT.
Nach Abschluß der Klonierungen wurden alle Bereiche, die durch PCR amplifiziert
worden waren, sowie die Klonierungsschnittstellen und Übergänge vom Vektor zur cDNA durch
Sequenzierung (4.17) auf Mutationen oder Klonierungsartefakte hin untersucht.
5.7.2 Transiente Transfektion und Immuno-Blotting
Als Modellsystem zur Untersuchung einer möglichen internen Initiation der Translation
der drei murinen La/SS-B-cDNA-Isoformen diente die humane Zelllinie HeLa (3.8). Dabei
musste die Voraussetzung erfüllt sein, dass eine Unterscheidung des endogenen, humanen
La/SS-B-Proteins und des eventuell durch eine interne Initiation translatierten murinen
La/SS-B-Proteins möglich war. Für die Untersuchung des murinen La/SS-B-Proteins im
Immuno-Blot wurden humane HeLa-Zellen (3.8) mit den Vektoren, die unter 5.7.1 kloniert
wurden, transient transfiziert (4.31).
30 h nach Beginn der Transfektion wurden aus den transfizierten Zellen Zellextrakte
hergestellt (4.29) und diese in einem 10%igen SDS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt (4.38).
Die Probenvolumina betrugen jeweils 20 µl. Danach erfolgte der Transfer der Proteine durch
das Western-Blotting (4.40) auf eine PVDF-Membran. Die Detektion der humanen bzw.
murinen La/SS-B- und CAT-Proteine konnte gleichzeitig erfolgen, da alle Proteine verschiedene
MW besaßen und daher in der SDS-PAGE Laufunterschiede aufwiesen. Zur Detektion der
La/SS-B-Proteine wurde der mAK 5B9 (3.12) verwendet, mit dem sowohl endogenes, humanes
La/SS-B-Protein detektiert werden konnte, als auch murines La/SS-B-Protein (DRATHEN,
1997). Der polyklonale Digoxygenin-markierte anti-CAT-AK (3.12) detektierte nur die
Chloramphenicol-Acetyltransferase. Kreuzreaktivitäten zwischen den AK konnten
ausgeschlossen werden (GRÖLZ, 1998; PAUTZ, 1998). Die primären Immunkomplexe wurden
mit den AP-konjugierten Sekundär-AK anti-Dig (3.13) und anti-Maus-IgG (3.13) im
NBT/X-Phosphat-System (4.42) sichtbar gemacht. Die verwendeten Sekundär-AK waren
bereits dahingehend charakterisiert worden, dass sie keine Kreuzreaktivitäten zeigten (PAUTZ,
1998). Der Immuno-Blot ist in Abb. 15 dargestellt.
Um den Laufunterschied zwischen endogenem, humanem La/SS-B-Protein (ca. 50 kDa)
und murinem (ca. 45 kDa) zu verdeutlichen, wurde in Laufspur 1 ein NIH-3T3-Zellextrakt und in