verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

4 Methoden 41
[v/v] APS. Unter optimalen Bedingungen ließen sich mit einem kleinen Sequenziergel bis zu 800 b lesen,
mit einem großen bis zu 1200 b. Die gut gemischte Lösung wurde mittels einer Spritze zwischen die
schrägstehenden Glasplatten gegeben. Nach dem Gießvorgang wurde ein Vorkamm zwischen die Platten
gesetzt. Nach 2-3 h war die Polymerisation des Gels abgeschlossen und der Vorkamm konnte entfernt
werden. Stattdessen wurde ein sog. Haifischkamm eingesetzt, der die Taschen für die Proben formte.
Nachdem das Gel in die Sequenzierapparatur eingehängt worden war, wurde der Vorlauf des Gels bei
45°C für 30 min mit 1500 V bzw. 2200 V (kleine bzw. große Sequenziergele) gestartet. Als Laufpuffer
diente 1x TBE-Sequenzierungs-Puffer (45 mM Borsäure; 2,5 mM EDTA; 0,134 M Tris/HCl; pH 8,3-8,7).
Die Sequenzierreaktion wurde als cycle-Sequenzierung mit dem Thermo Sequenase fluorescent
labelled primer cycle sequencing kit mit 7-deaza-dGTP (3.5) durchgeführt. 1-2 µg der zu sequenzierenden
DNA wurden mit 2 pmol infrarotgelabeltem Sequenzierungsprimer vermischt und der Ansatz mit aqua
dest. auf 18,75 µl aufgefüllt. Je 4,5 µl dieser Mischung wurden dann in vier PCR-Reaktionsgefäße
pipettiert und je 1,5 µl Terminationsmix (A, C, G oder T) des Thermo Sequenase Kits zugegeben. Dieser
enthielt neben der thermostabilen DNA-Polymerase auch die erforderlichen dNTPs und ddNTPs. Die
cycle-Sequenzierreaktion wurde unter Standard-PCR-Bedingungen durchgeführt (4.18). Danach wurden
die Ansätze zur Denaturierung für 3 min auf 95°C erhitzt, sofort auf Eis gestellt und mit je 3 µl
Stop/Ladepuffer (95% Formamid [v/v]; 0,1% [v/v] Xylencyanol; 10 mM EDTA; 0,1% [w/v] Bromphenolblau)
versetzt. Im Anschluss wurden 1,5 µl der Proben in der Reihenfolge A, C, G und T auf das Gel
aufgetragen und die Elektrophorese für 6-7 h bei 1500 V bzw. 2200 V durchgeführt.
4.18 Polymerase-Ketten-Reaktion
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) wurde erstmals von SAIKI et al. (1985) und MULLIS et al.
(1986) beschrieben. Hierbei wurde in einem 50 µl-Reaktionsgemisch eine DNA-Vorlage (1 ng
Plasmid-DNA oder 500 ng genomische DNA) mit zwei flankierenden Oligonukleotiden mit
entgegengesetzter Orientierung (je 10 pmol) durch die hitzestabile Polymerase aus Thermus aquaticus
(Taq) (1 U) unter Zusatz der vier verschiedenen dNTPs (je 0,2 mM) in einem Thermocycler amplifiziert.
Dies geschah nach einer initialen Denaturierung (Aufschmelzen der DNA-Doppelstränge) bei 95°C für
5 min in 35 Zyklen durch Denaturierung für je 30 sec bei 95°C, durch Anlagerung der Oligonukleotide für
je 45 sec bei 56°C und durch Neusynthese des komplementären DNA-Stranges (Elongation) durch die
Taq-Polymerase für je 2 min bei 72°C und schließlich durch terminale Elongation für 10 min bei 72°C.
Zuletzt erolgte eine Abkühlung auf 4°C. Die Taq-Polymerase, deren Temperaturoptimum bei 72°C lag,
zeigte bei 95°C nur eine langsame Aktivitätsabnahme (INNIS et al., 1988). Der Nachteil dieser
Polymerase lag in ihrer relativ hohen Fehlerquote von etwa 2 x 10 -4 Fehlern pro eingebauter Base (CHA
und THILLY, 1993). Die Taq-Polymerase amplifiziert pro min ca. 1 kb DNA. Die 3’-Enden der
Oligonukleotide dienten ihr als Reaktionsstartpunkt. Da bei einer PCR mit genomischer DNA
Fragmentlängen unbekannter Größe amplifiziert wurden, wurde die Elongationszeit bis auf das Maximum
der Taq-Polymerase ausgedehnt (6-7 min). Durch die Variation der Anlagerungs-Temperatur (55-65°C)
konnte die Stringenz, mit der synthetische Oligonukleotide an der Zielsequenz banden, erhöht bzw.
erniedrigt werden, da bei niedriger Anlagerungs-Temperatur u.U. auch Hybride mit Fehlpaarungen stabil
bleiben konnten. Insbesondere bei Primern, die durch die Synthese einer Klonierungs-Schnittstelle
Basenfehlpaarungen zur Zielsequenz aufwiesen, wurde die Stringenz niedrig gehalten und die günstigste