verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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4 Methoden
4.16 Transformation kompetenter E. coli-Bakterien
1 ng Plasmid-DNA oder 5 µl eines Ligationsansatzes wurden mit aqua dest. auf ein Endvolumen
von 40 µl aufgefüllt und auf Eis gestellt. Ein Aliquot kompetenter Bakterien wurde aus dem -70°C-Vorrat
entnommen und auf Eis aufgetaut. Die Bakterien und die DNA-Lösung wurden gemischt und der Ansatz
für 30 min auf Eis inkubiert. In dieser Zeit lagerte sich die DNA an die Zellwände der Bakterien an. Ein
Hitzeschock für 2 min bei 42°C bewirkte die Aufnahme der DNA in die Bakterien (SAMBROOK et al.,
1989). Im Anschluss wurde der Ansatz für 2 min auf Eis inkubiert. Danach wurde der
Transformationsansatz in 1,5 ml LB-Medium gegeben und bei 200 rpm für 1 h bei 37°C inkubiert. In
dieser Zeit konnte sich die Antibiotikumsresistenz ausbilden, die die transformierten Bakterien durch die
Aufnahme eines Plasmids erhalten hatten. Schließlich wurden die Bakterien durch Zentrifugation für 5 min
bei 400 g pelletiert. Das zellfreie LB-Medium wurde dekantiert und die Bakterien mit 100 µl LB-Medium
resuspendiert. Anschließend wurde die bakterienhaltige Lösung auf 37°C warme Agarplatten (4.2) mit
einem Drigalsky-Spatel auf der Agar-Oberfläche ausplattiert. Im Anschluss erfolgte eine 16stündige
Inkubation bei 37°C. Die Agarplatten konnten, mit Parafilm versiegelt, für ca. 3-4 Tage bei 4°C aufbewahrt
werden. Bei zu langer Inkubation oder nach mehr als vier Tagen Aufbewahrungszeit entstanden
Satellitenkolonien, da die Hauptkolonie das meiste an Antibiotikum abgebaut hatte und nun in ihrer nahen
Umgebung Bakterien mit der Teilung beginnen konnten, die keine Resistenz besaßen. Von zufällig
ausgewählten Kolonien wurden durch Picken ÜNKs (4.3) angelegt.
4.17 DNA-Sequenzierung
Bei dieser von SANGER et al. (1977) vorgestellten enzymatischen Methode der Sequenzierung
wurden basenanaloge 2’,3’-Didesoxynukleosidtriphosphate als spezifische Kettenverlängerungs-
Inhibitoren der DNA-Polymerase für eine kontrollierte Unterbrechung der DNA-Replikation genutzt. Auf
Grund des Fehlens der 3’-Hydroxyl-Gruppe brach die Ketten-Elongation mit dem Einbau eines ddNTP ab.
Wenn Primer und DNA-Vorlage in Anwesenheit aller vier dNTPs und eines bestimmten ddNTPs mit
DNA-Polymerase in einem Ansatz inkubiert wurden, entstand ein Gemisch aus unterschiedlich langen
Fragmenten, die am 3’-Ende eines der vier ddNTPs trugen. Somit kam es an statistisch verteilten
Positionen der neusynthetisierten DNA zu Kettenabbrüchen. Verwendet wurde ein automatisches
DNA-Sequenziergerät, das für die Markierung Primer benutzte, die mit einem Infrarotfarbstoff gekoppelt
waren. Während der elektrophoretischen Auftrennung wurden die markierten DNA-Fragmente durch
einen Laserstrahl angeregt und emittierten infrarotes Licht mit einer Wellenlänge von 790 nm. Das
erhaltene IR-Leitermuster zeigte die Verteilung der IR-markierten DNA an. Wenn analog dazu für alle vier
Nukleotide (A,C,G und T) Ansätze hergestellt und parallel auf das Gel aufgetragen wurden, konnte
anhand des Bandenmusters die Sequenz der DNA direkt abgelesen werden. Zur Auswertung wurden die
Sequenzen mit verschiedenen Computerprogrammen bearbeitet (3.17).
Zwei Glasplatten wurden mit aqua dest. gereinigt und mit Isopropanol entfettet. Dies war wichtig,
da jegliche Verunreinigung den Lauf der Proben störte. Zwischen die Glasplatten wurden randständige
Abstandshalter von 0,25 mm Dicke eingesetzt. Kleine Sequenziergele setzten sich aus 80% [v/v]
Sequagel XR, 20% [v/v] Sequagel complete und 0,1% [v/v] APS zusammen. Große Gele bestanden aus
72% [v/v] Sequagel XR, 20% [v/v] Sequagel complete, 8,4% [v/v] Harnstoff, 1% [v/v] DMSO und 0,1%