verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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4 Methoden
4.5 Schnelle Plasmid-Mini-DNA-Präparation
Diese DNA-Isolierung wurde mit dem QIAprep-spin Plasmid Mini Kit (3.5) durchgeführt, mit dem
sich ca. 5-10 µg DNA gewinnen ließen. Mini-DNA wurde zum schnellen Überprüfen von Klonierungen, für
Sequenzierungen oder zur Transformation eingesetzt. Von einer bakteriellen ÜNK wurden 2 ml
entnommen und für 3 min bei 5000 g abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Bakterienpellet
in 250 µl P1 resuspendiert und mit 250 µl P2 5 min bei RT alkalisch lysiert. Mit der Zugabe von 350 µl N3
wurde die Lösung neutralisiert, die Bakterienlyse gestoppt und die für die Affinitätsmatrix notwendige
Salzkonzentration eingestellt. Nach einer Inkubation von 5 min auf Eis war die Fällung von denaturierten
Proteinen, genomischer DNA, Zelltrümmern und SDS vollständig. Es folgte eine 10minütige Zentrifugation
bei 16000 g. Nachfolgend wurde der Überstand auf die Qiaprep-Spin-Säulen gegeben und mit 16000 g für
30 sec abzentrifugiert, wobei die Plasmid-DNA an der Silica-Matrix band. Es folgen zwei Waschschritte
mit je 0,75 ml PE durch Zentrifugation mit jeweils16000 g für 30 sec. Schließlich erfolgte die Elution der
DNA mit 40 µl TE (10 mM Tris/HCl; 1 mM EDTA; pH 7,3-8,3) oder aqua dest.
4.6 Plasmid-Midi-DNA-Präparation
Verwendet wurde das QIAGEN Plasmid Midi Kit (3.5), mit dem sich ca. 500-1000 µg DNA
gewinnen ließen. Eine 40 ml ÜNK wurde für 10 min mit 5000 g bei 4°C zentrifugiert und das
Bakterienpellet in 4 ml P1 resuspendiert. Die Lyse wurde durch Zugabe von 4 ml P2 bei RT gestartet und
nach 5 min mit 4 ml P3 gestoppt. Danach inkubierte die Lösung für 15 min auf Eis. Zellreste konnten
durch Zentrifugation bei 5000 g bei 4°C für 30 min sedimentiert werden. Der Überstand wurde auf eine mit
5 ml QBT äquilibrierte Qiagen-Tip 100-Säule aufgetragen. Dann wurde 2mal mit je 10 ml QC gewaschen
und die Plasmid-DNA anschließend mit 5 ml QF eluiert. Die Lösung wurde mit 0,7 Volumenanteilen
Isopropanol bei RT gut durchmischt und die DNA für 30 min mit 16000 g bei 4°C abzentrifugiert. Das
Pellet wurde mit 250 µl 70%igem Ethanol gewaschen, um Reste des schwerer flüchtigen Isopropanols zu
entfernen. Im Anschluss wurde das Pellet bei 37°C getrocknet und schließlich in 80 µl TE (10 mM
Tris/HCl; 1 mM EDTA; pH 7,3-8,3) oder aqua dest. resuspendiert. Um die Nukleinsäuren vollständig in
Lösung zu bringen, wurde die Flüssigkeit mehrfach kurz bei 50°C inkubiert, gut durchmischt, auf Eis
gestellt und zum Schluß kurz herunterzentrifugiert.
4.7 Aufbewahrung von DNA
DNA blieb für viele Jahre bei -20°C, gelöst in TE (10 mM Tris/HCl; 1 mM EDTA; pH 7,3-8,3), stabil
(SAMBROOK et al., 1989). Das im Puffer enthaltene EDTA band den für DNasen notwendigen Kofaktor
Mg 2+ . Der basische pH-Wert verhinderte eine autokatalytische Zersetzung der DNA infolge ihrer sauren
Eigenschaften. Für eine kurzfristige Aufbewahrung von DNA eignete sich als Lösungsmittel auch aqua
dest.. So konnten bei einer Weiterverarbeitung der DNA die für Enzyme notwendigen speziellen
Salzkonzentrationen unproblematischer eingestellt werden.