verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

5 Ergebnisse 87
5.9.4 Western-Blotting und Immundetektion
Zur Überprüfung der Immunogenität des rek. His-tag-Fusionsproteins wurden jeweils
2 µl des Totalextrakts, der ersten beiden Waschfraktionen und der drei Eluatfraktionen durch
eine 10%ige SDS-PAGE (4.38) aufgetrennt und durch das Western-Blotting auf eine
PVDF-Membran transferiert (4.40). Die indirekte Immundetektion (4.41) der immobilisierten
Proteine erfolgte mit dem mAK 5B9 (3.12) und dem mit AP konjugierten
anti-Maus-IgG-Sekundär-AK (3.13). Dieser war bereits dahingehend charakterisiert worden,
dass keine Kreuzreaktivitäten auftraten. Der Nachweis erfolgte durch das
NBT-/X-Phosphat-System (4.42). Dieses System war sensitiver als die Färbung der SDS-Gele
mit Coomassie-Brillant-Blau (4.39).
Abb. 17: Immuno-Blot zur murinen La/SS-B-
Proteinexpression
Als Marker wurde der LMW-Marker (3.16) verwendet.
1) Totalextrakt
2) 1. Waschfraktion mit bakt. Proteinen
3) 2. Waschfraktion mit bakt. Proteinen
4) 1. Eluatfraktion mit rek. murinem La/SS-B-Protein
5) 2. Eluatfraktion mit rek. murinem La/SS-B-Protein
6) 3. Eluatfraktion mit rek. murinem La/SS-B-Protein
Auf Grund der höheren Sensitivität des Immuno-Blots ließ sich das rek.
His-tag-Fusionsprotein mit einem MW von etwas über 45 kDa im Totalextrakt und in allen
Eluatfraktionen nachweisen (Abb. 17: Laufspuren 1, 4, 5 und 6). Somit bestätigte sich die
Vermutung, dass das rek. His-tag-Fusionsprotein auch in der dritten Eluatfraktion enthalten war
und nur auf Grund der niedrigeren Nachweisgrenze der Coomassie-Brillant-Blau-Färbung nicht
detektiert werden konnte. Bei den Waschfraktionen (Abb. 17: Laufspuren 2 und 3) ließ sich kein
rek. His-tag-Fusionsprotein detektieren.
Im Immuno-Blot waren beim Totalextrakt und den drei Eluatfraktionen (Abb. 17) neben
den rek. His-tag-Fusionsprotein-Banden mit einem MW von etwa 45 kDa weitere Banden mit
MW von ungefähr 43 und 28 kDa zu erkennen. Hierbei handelte es sich vermutlich um
Degradationsprodukte des rek. His-tag-Fusionsproteins, da diese Banden nicht in den
Waschfraktionen (Abb. 17: Laufspuren 2 und 3) detektiert werden konnten.
Die unter 5.9.3 und 5.9.4 erhaltenen Ergebnisse ließen sich wie folgt kurz
zusammenfassen: Das murine La/SS-B-Protein konnte im bakteriellen Expressionssystem als
rek. His-tag-Fusionsprotein in ausreichender Menge exprimiert und unter nativen Bedingungen
gereinigt werden, so dass es für weitere Experimente zur Verfügung stand (5.10 und 5.12).