verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

4 Methoden 55
1x TBS (150 mM NaCl; 50 mM Tris/HCl; pH 7,5) gewaschen. Dann folgte die 45minütige Inkubation mit
dem primären AK. Anschließend wurde 5mal 5 min mit 1x TBST (1x TBS mit 1% [v/v] Tween 20)
gewaschen, bevor sich die 45minütige Inkubation mit dem sekundären AK anschloß. Schließlich wurde
3mal für 5 min mit 1x TBST gewaschen, bevor die Nachweisreaktion erfolgte (4.42 und 4.43).
4.42 Nachweisreaktion mit dem NBT-X-Phosphat-(BCIP-) System
Die Nachweisgrenze des NBT-X-Phosphat-Färbesystems lag bei 100 pg Protein. Bei dieser
Methode war das Enzym AP an den sekundären AK gekoppelt. Das Substrat X-Phosphat (BCIP =
5-Brom-4-Chlor-3-indolylphosphat) wurde hydrolytisch gespalten, wodurch ein unlöslicher blauer Indigo-
Niederschlag entstand. Im alkalischen Medium gab Indigo Protonen ab, die den Farbverstärker
Nitroblautetrazoliumchlorid (NBT) zu purpurfarbenem Diformazan reduzierten (BLAKE et al., 1984). Die
Proteine wurden als lila Banden sichtbar. Der Blot wurde 2mal für 3 min mit P3 (100 mM Tris/HCl;
100 mM NaCl; 50 mM MgCl 2 ; 0,1% [v/v] DEPC; pH 9,5) gewaschen. Anschließend wurde der Blot mit
100 µl/cm 2 NBT-X-Phosphat-Substratlösung (4,5 µl NBT-Stammlösung und 2,5 µl X-Phosphat-
Stammlösung pro ml P3) bei 37°C für ca. 5 min inkubiert. Während der Farbentwicklung wurde der
Ansatz abgedunkelt aufbewahrt, um ein Ausfallen des Farbkomplexes auf der Membran zu vermeiden.
Die Reaktion wurde durch Waschen in 1x PBS (0,8 mM Na 2 HPO 4 ; 0,1 mM KH 2 PO 4 ; 0,14 mM NaCl;
0,26 mM KCl; pH 7,4) für 5 min gestoppt. Anschließend wurde der Blot auf Filterpapier luftgetrocknet und
unter Lichtausschluß aufbewahrt, da es sonst zum Ausbleichen der Farbstoffkomplexe kam.
4.43 Nachweisreaktion mit dem ECL-System
Verwendet wurde das ECL-Blotting-Reagenz (3.5). Die Nachweisgrenze der verstärkten
Chemolumineszenz (ECL) lag bei 1 pg Protein. Bei diesem Nachweissystem war der sekundäre AK mit
POD gekoppelt, das als Substrat H 2 O 2 benötigte. Bei der Reaktion entstand ein Sauerstoffion, das unter
Einfluß des Reduktionsmittels Luminol (Diazylhydrazid = 5-Amino-2,3-dihydrophthalazin-1,4-dion)
oxidierte. Luminol wurde dabei zu 3-Aminophthalat umgewandelt, das bei Rückkehr in den Grundzustand
Photonen der Wellenlänge 425 nm emittierte (ROSWELL und WHITE, 1978). Diese Lichtemissionen
wurden durch 4-Jodophenol verstärkt, da dieses als Radikalüberträger zwischen H 2 O 2 und Luminol
fungierte. Da die Lichtemission proportional zur Enzymkonzentration und damit zur AK-Konzentration war,
eignete sich das ECL-System für vergleichende Quantifizierungen. Der Blot wurde in der Dunkelkammer
angetrocknet und mit 100 µl/cm 2 Detektionslösung (1% [v/v] Startlösung B in
Lumineszenzsubstratlösungen A; Inkubation für 30 min bei RT im Dunkeln) überschichtet und für 1 min
inkubiert. Schließlich wurde die Membran auf Filterpapier angetrocknet, in eine Plastikfolie eingeschlagen,
in die Expositionskammer gelegt und Röntgenfilme aufgelegt. Die Expositionszeit betrug zwischen 30 sec
und 30 min. Zur Entwicklung wurden die Filme 5 min in ein Bad mit Röntgenfilm-Entwickler (1:5 verdünnt
mit aqua dest.) gelegt, in aqua dest. gespült, 3 min in ein Bad mit Röntgenfilm-Fixierer (1:5 verdünnt mit
aqua dest.) überführt, wieder mit aqua dest. gespült und im Anschluss getrocknet.