verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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4 Methoden
4.33 In situ-Hybridisierung
Die Markierung der in der in situ-Hybridisierung verwendeten Oligos wurde mit dem Dig
Oligonucleotide Tailing Kit (3.5) durchgeführt. Auf Eis wurden 4 µl 5x Reaktionspuffer, 4 µl CoCl 2 -Lösung,
100 pmol Oligonukleotide, 1 µl Dig-dUTP-Lösung, 1 µl dATP-Lösung und 1 µl terminale Transferase
zusammenpipettiert, mit aqua dest. auf ein Gesamtvolumen von 20 µl aufgefüllt und für 15 min bei 37°C
inkubiert. Zum Abstoppen der Enzymreaktion wurden 1 µl Glycogen-Lösung mit 200 µl EDTA-Lösung
(0,2 M EDTA in aqua dest.; pH 8,0) gemischt und 2 µl dieser Verdünnung zu dem Reaktionsansatz
gegeben. Zum Präzipitieren wurde 2,5 µl LiCl-Lösung (4 M LiCl in aqua dest.) und 75 µl eiskaltes Ethanol
p.a. zugefügt und für 30 min bei -70°C oder für 2 h bei -20°C inkubiert. Im Anschluss wurde der Ansatz für
30 min mit 16000 g bei 4°C abzentrifugiert, das Pellet mit 50 µl kaltem 70%igen Ethanol gewaschen, bei
37°C getrocknet und in 20 µl DEPC-H 2 O (aqua dest. mit 0,1% [v/v] DEPC) aufgenommen. Die Proben
wurden bei -20°C aufbewahrt.
Mittels eines Dot Blots konnte die Effizienz der Markierungsreaktion ermittelt werden. 1 µl der
Dig-markierten Sonde wurde mit aqua dest. 1:10, 1:100, 1:1.000 und 1:10.000 verdünnt und je 1 µl der
Verdünnung auf eine Nylonmembran aufgetragen, die anschließend für 30 min an der Luft getrocknet
wurde. Danach wurde die Membran für 5 min in Maleinsäurepuffer (100 mM Maleinsäure; 150 mM NaCl;
0,1% [v/v] DEPC; pH 7,5) und anschließend zum Absättigen unspezifischer Bindestellen für 15 min in
Maleinsäurepuffer mit 1% [w/v] Blocking-Reagenz (Roche) inkubiert. Der Nachweis der eingebauten
Digoxigenin-Moleküle erfolgte mit anti-Dig AP-Konjugat (F ab Fragmente) (3.13) für 45 min bei RT. Danach
wurde die Membran 2mal 10 min in Maleinsäurepuffer und 5 min in Äquilibrierungspuffer (100 mM
Tris/HCl; 100 mM NaCl; 50 mM MgCl 2 ; 0,1% [v/v] DEPC; pH 9,5) gewaschen. Die Detektion mit dem
NBT-X-Phosphat-System erfolgte wie unter 4.42 beschrieben. Die Farbreaktion sollte bis zu einer
Verdünnung von 1:10.000 noch sichtbar sein. Durch Vergleich der Farbintensitäten mit einer
Standardreihe ließ sich ermitteln, wie gut die Markierung gelungen war.
Nachdem Zellen, die auf Deckgläschen ausgesät worden waren, die gewünschte Konfluenz
erreicht hatten, wurden die diese entnommen und 2mal für 1 min mit 1x PBS (0,8 mM Na 2 HPO 4 ; 0,1 mM
KH 2 PO 4 ; 0,14 mM NaCl; 0,26 mM KCl; pH 7,4) gespült. Im Anschluss daran erfolgte die Inkubation für
10 min in PFA-Lösung (4% [w/v] in 1x PBS; pH 7,2). Danach wurde 2mal für 5 min mit 1x PBS
gewaschen. Schließlich wurden die Zellen in einer aufsteigenden Ethanol-Reihe (30%, 50% und 70%)
jeweils für 5 min entwässert. Die Deckgläschen konnten, überschichtet mit 70% Ethanol, bei 4°C
aufbewahrt werden. Zur in situ-Hybridisierung wurden die Zellen 2mal für 5 min in 90% Ethanol und 2mal
für 5 min in Ethanol p.a. gewaschen und anschließend an der Luft getrocknet. Die Dig-markierten Sonden
wurden mit 2x SSC/FA (50% [v/v] 2x SSC; 50% [v/v] Formaldehyd) 1:20 verdünnt. Durch Formaldehyd
wurden die Schmelzpunkte der Sonden halbiert. Die Berechnung der Hybridisierungstemperatur erfolgte
mit der Formel, die unter 4.18 angegeben war. 10 µl der verdünnten Sonde wurde auf autoklavierte
Objektträger pipettiert und die Deckgläschen luftblasenfrei aufgelegt. Die Inkubation erfolgte über Nacht
bei der entsprechenden Hybridisierungstemperatur der Sonden im Wasserbad in einer geschlossenen
Metallkammer. Nach der Inkubation wurden die Objektträger in einer Glasküvette, die mit auf die
Hybridisierungstemperatur vorgewärmten 2x SSC (0,03 M Trinatriumcitrat Dihydrat, 0,3 M NaCl; 0,1%
DEPC; pH 7,0) gefüllt war, vorsichtig geschwenkt, bis sich die Deckgläschen abnehmen ließen. Im
Anschluss wurden die Deckgläschen 3mal 20 min mit 0,1x SSC bei der Hybridisierungstemperatur, 2mal
5 min mit PBT (0,2% [w/v] BSA; 0,1% [v/v] Tween 20; in 1x PBS) bei RT und 15 min mit P2 bei RT