verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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4 Methoden
Dadurch gelang es, Fragmente in einem Größenbereich von wenigen Basenpaaren Unterschied als
getrennte Banden darzustellen und zu isolieren. Das erstarrte Gel wurde schließlich in die
Elektrophoresekammer gelegt und mit 1x TAE-Elektrophoresepuffer bedeckt. Die zu analysierende
DNA-Lösung wurde mit 6x DNA-Probenpuffer (40% [w/v] Saccharose; 0,25% [w/v] Bromphenolblau) 1:6
vermischt. Der Puffer enthielt Saccharose, die das spezifische Gewicht der Probe erhöhte und so ihr
Absinken in die Probentasche bewirkte. Auf das Gel wurde ein DNA-Marker (3.14) aufgetragen. Die
Elektrophorese wurde mit 3-5 V/cm Elektrodenabstand durchgeführt (SAMBROOK et al., 1989). Anhand
der Wanderung des im DNA-Probenpuffer enthaltenen anionischen Farbstoffes Bromphenolblau konnte
der Verlauf der Elektrophorese verfolgt werden. Die Farbfront bewegte sich auf der Höhe von DNA mit
einer Größe von ca. 500 bp (AUSUBEL et al., 1987).
4.9.2 RNA-Agarosegele
Die Herstellung von RNA-Agarosegelen erfolgte in Anlehnung an die Herstellung von
DNA-Agarosegelen (4.9.1). Für die Herstellung eines RNA-Gels wurden 1% [w/v] Agarose, 20% [v/v]
10x MOPS (20 mM MOPS; 5 mM NaOAc; 1 mM EDTA; pH 7,0) und 80% [v/v] DEPC-H 2 O (aqua dest. mit
0,1% [v/v] DEPC) aufgekocht, bis die Lösung klar erschien. Der auf 60°C abgekühlten Agarose-Lösung
wurde deionisiertes Formaldehyd bis auf eine Endkonzentration von 2% [v/v] beigefügt, das denaturierend
auf Nukleinsäuren wirkte und dadurch die Bildung von Sekundärstrukturen innerhalb der RNA verhinderte.
Da auch Proteine denaturiert wurden, bestand während der Elektrophorese keine Gefahr durch RNasen.
Die Agar-Lösung wurde in eine Gelform gegossen, in der die Polymerisation für 1 h erfolgte. Pro Laufspur
wurden 5 µg RNA 4:1 mit 4x RNA-Probenpuffer (50% [v/v] deionisiertes Formamid; 16,7% [v/v]
deionisiertes Formaldehyd; 10% [v/v] Glycerin; 0,5% [w/v] Bromphenolblau; in 1x MOPS) und DEPC-H 2 O
gemischt, zum Denaturieren für 15 min bei 65°C erhitzt und dann für 5 min auf Eis inkubiert. Auf das Gel
wurde ein Dig-markierter RNA-Marker (3.15) aufgetragen. Die Elektrophorese wurde in 1x MOPS bei
höchstens 3 V/cm Elektrodenabstand durchgeführt
4.10 Nachweis von Nukleinsäuren in Agarosegelen
Nukleinsäuren ließen sich durch interkalierende Substanzen wie Ethidiumbromid anfärben. Dieser
Farbstoff fluoreszierte rot-orange bei Anregung mit UV-Licht (254 oder 302 nm) (CRAWFORD und
WARING, 1967). Die Nachweisgrenze lag bei doppelsträngigen DNA-Fragmenten je nach Länge und
Dicke des verwendeteten Agarosegel-Typs zwischen 1 und 10 ng/Bande. Die Färbung von Agarosegelen
erfolgte für ca. 15 min in einem Ethidiumbromid-Bad (2 µg/ml in aqua dest.). Nach einem 10minütigen
Waschschritt in aqua dest. wurden die einzelnen Banden auf einem langwelligen UV-Transilluminator
sichtbar gemacht.
Mit Toluidinblau konnten Nukleinsäuren mit 100 ng/Bande sichtbar gemacht werden. Die Färbung
von Agarosegelen erfolgte für 25 min in einem Toluidinblau-Bad (0,1% [w/v] in aqua dest.). Nach einem
30minütigen Waschschritt in aqua dest. wurde der Hintergrund reduziert und die einzelnen Banden
sichtbar gemacht. Ein Video-Gel-Dokumentationssystem ermöglichte das Photographieren der Gele, das
Ausdrucken der Bilder auf Thermopapier und das Digitalisieren der Bilder.