verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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4 Methoden
Trypsin/EDTA-Lösung (1,5% [w/v] Trypsin; 0,02% [w/v] EDTA; in 1x PBS) hinzugefügt. Nach 2-10 min
Inkubation bei 37°C lösten sich die Zellen vom Boden der Kulturflasche ab. Zum Abstoppen der
Trypsinreaktion wurde 0,5 ml/cm 2 Kulturmedium hinzugefügt. Schließlich wurden die Zellen mit einer
angemessenen Zellzahl pro cm 2 in eine neue Kulturflasche ausgesät. Dabei richtete sich die Zellzahl nach
der Wachstumsrate und Größe der Zellen.
4.28 Gefrierkonservierung und Auftauen von Eukaryontenzellen
Abtrypsinierte Zellen wurden für 10 min bei 400 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen,
während das Zellpellet in 5 ml Einfriermedium (3.7) resuspendiert wurde. Dieses enthielt als
Gefrierschutzmittel 10% [v/v] DMSO, was Kristallbildungen während des Einfriervorgangs verhinderte. Je
1,5 ml der suspendierten Zellen wurden in Kryoröhrchen umgefüllt und in flüssigen Stickstoff endgelagert.
Eine stufenweise Adaption an die Temperatur von -196°C ermöglichte den Zellen die osmotische Abgabe
von intrazellulärem Wasser.
Zum Auftauen wurde ein Kryoröhrchen mit eingefrorenen Zellen in einem 37°C warmen
Wasserbad aufgetaut. Sobald sich das Einfriermedium verflüssigt hatte, wurden die Zellen für 10 min bei
400 g pelletiert. Der Überstand wurde verworfen, während das Zellpellet in Kulturmedium (3.7)
resuspendiert und in eine Kulturflasche mit 0,5 ml/cm 2 Kulturmedium überführt wurde.
4.29 Herstellung von Proteinextrakten aus Eukaryontenzellen
Für die SDS-PAGE wurden Proteinextrakte aus Eukaryontenzellen hergestellt. Dazu wurde das
alte Kulturmedium entfernt und die Zellen mit 1x PBS (0,8 mM Na 2 HPO 4 ; 0,1 mM KH 2 PO 4 ; 0,14 mM NaCl;
0,26 mM KCl; pH 7,4) bedeckt. Dieses wurde anschließend gründlich abgesaugt und die Zellen mit
10 µl/cm 2 95°C heißem 1x SDS-Probenpuffer (100 mM DTT; 10% [w/v] SDS; 50% [v/v] Glycerin; 0,5%
[w/v] Bromphenolblau; 50 mM Tris/HCl; pH 6,8) überschichtet. Die lysierten Zellen wurden mit einem
Zellschaber homogenisiert und in ein Reaktionsgefäß überführt. Genomische DNA, die den Zellextrakt
sehr viskos machte, wurde durch Zentrifugation für 5 min bei 16000 g pelletiert. Der Proteinextrakt konnte
bei -20°C aufbewahrt werden.
4.30 Bestimmung der Zellzahl von Eukaryontenzellen
Die Bestimmung der Zellzahl von aus einer konfluenten Kulturflasche abtrypsinierten Zellen
erfolgte mit der Neubauer-Zählkammer. Ein geeichtes Deckgläschen wurde befeuchtet und so auf die
Kammer gelegt, dass zwischen den seitlichen Rändern des Deckglases und der Kammer Newton’sche
Ringe sichtbar waren. Dann wurde die Kammer mit einem Tropfen der Zellsuspension gefüllt. Unter dem
Umkehrmikroskop wurden acht Felder der Kammer ausgezählt. Die Anzahl der gezählten Zellen
multipliziert mit dem Faktor 20.000 ergab die Zellzahl pro ml Kulturmedium.