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102 6 Diskussion A) Sequenzen der Exon-Intron-splice-Übergänge im humanen La/SS-B-Gen Bezeichnung Exon 3’ Intron 5’ Intron 3’ Exon 5’ Bezeichnung Exon 1 ...GCTTTGCT GGTGCGCG... ...TTTTACAG ATAGCCGC... Exon 2 Exon 1’ ...GGGAAAAC GTGGGTAA... ...TTTTACAG ATAGCCGC... Exon 2 Exon 1’’ ...AAACGTGG GTAATATT... ...TTTTACAG ATAGCCGC... Exon 2 Exon 2 ...AAATTGAG GTATGATT... ...TCTCACAG TATTATTT... Exon 3 Exon 3 ...TTCAACAG GTAACAAG... ...CTCTTCAG GTTGAACC... Exon 4 Exon 4 ...TTTATATT GTAAGTGG... ...CTTCACAG AAAGGCTT... Exon 5 Exon 5 ...CATTTAAG GTATGATA... ...TTTTACAG GGATCAAT... Exon 6 Exon 6 ...CTTTTCAA GTAAGTCT... ...TTCTTTAG GGACGATT... Exon 7 Exon 7 ...GCTAAACA GTAAGTAT... ...ATTTGTAG GGAGCAAG... Exon 8 Exon 8 ...CTGAAATG GTAAGTAT... ...TTTTATAG AAATCTCT... Exon 9 Exon 9 ...CAAAAGAG GTCAGAGG... ...TGGTATAG GGGATAAT... Exon 10 Exon 10 ...TGCAACTG GTAAGTTT... ...CGTTATAG GACCTGTG... Exon 11 B) Sequenzen der Exon-Intron-splice-Übergänge im murinen La/SS-B-Gen Bezeichnung Exon 3’ Intron 5’ Intron 3’ Exon 5’ Bezeichnung Exon 1a ...AATCTTTG AGGTGAGC... ...TTCCTACC AGTGTGAG... Exon 2 Exon 1b ...TGAGGAGA AGGTACGA... ...TTCCTACC AGTGTGAG... Exon 2 Exon 1c ...ACTTTGCT TTACCAAC... ...ATTCACAG TATTATTT... Exon 2 Exon 2 ...AAATTGAG GTATGATT... ...ATTCACAG TATTATTT... Exon 3 Exon 3 ...TTCAACAG GTAAGTCT... ...CTTTTCAG GCTAAACC... Exon 4 Exon 4 ...TTTATATT GTAAGTGG... ...TTTTACAG AAAGGTTT... Exon 5 Exon 5 ...CATTTAAG GTATGATA... ...CTTTACAG GGGTCAAT... Exon 6 Exon 6 ...CTCTTTAA GTAAGTCT... ...TTCTTCAG GGAAGATT... Exon 7 Exon 7 ...GCTAAACA GTAAGTCT... ...GTTTTTAG AGAGCATG... Exon 8 Exon 8 ...CTGAAACC GTAAGTAC... ...TTTTATAG AGAGCTCT... Exon 9 Exon 9 ...CAAAAGAG GTTTGGAA... ...ATGTGTAG GGAATAAT... Exon 10 Exon 10 ...TCGTCGTG GTAAGTCT... ...TGTAATAG GACCAATG... Exon 11 Tabelle 3: Sequenzen der Exon-Intron-splice-Übergänge im (A) humanen La/SS-B-Gen (GRÖLZ, 1998) und (B) murinen La/SS-B-Gen Dargestellt sind jeweils acht Nukleotide auf der 3’-Seite eines vorangehenden Exons, auf der 5’- und 3’-Seite des nachfolgenden Introns und auf der 5’-Seite eines darauffolgenden Exons. 6.4 Der Basis-Promotor Eukaryontische Pol II-Promotoren bestanden aus einem core-Promotor-Element (Basis-Promotor) sowie aus genspezifischen, regulatorischen DNA-Elementen (TJIAN und MANIATIS, 1994; KOLESKE und YOUNG, 1995; KORNBERG, 1996). Das core-Promotor-Element bildete das minimale DNA-Element, das für die Transkriptions-Initiation durch die RNA-Pol II in vitro notwendig und ausreichend war. Die regulatorischen Elemente bestanden aus den die Transkription verstärkenden enhancer- und abschwächenden silencer-Elementen und konnten über einen weiten Bereich, sowohl stromaufwärts wie auch stromabwärts vom Transkriptionsstart, verteilt sein. An das core-Promotor-Element banden verschiedene generelle Transkriptionsfaktoren (GTFs), rekrutierten die Pol II und bildeten den basalen Transkriptionsapparat (BURATOWSKI, 1994; ROEDER, 1996). An die enhancer- und silencer-Elemente banden regulatorische Faktoren, die Aktivatoren bzw. Repressoren. Die Interaktion zwischen dem basalen Transkriptionsapparat und den regulatorischen Faktoren konnte vermutlich über verschiedene Kofaktoren erfolgen. Als Kofaktoren wurden mit dem TATA-Box-Bindeprotein (TBP) assoziierte Faktoren (TAFs), lösliche generelle Kofaktoren und mit dem C-terminalen Ende der Pol II direkt interagierende Mediatoren beschrieben
6 Diskussion 103 (VERRIJZER und TJIAN, 1996; KAISER und MEISTERERNST, 1996; BJÖRKLUND und KIM, 1996). Der core-Promotor wurde bei den meisten Genen durch die etwa 30 bp stromaufwärts vom Transkriptionsstart gelegene TATA-Box gebildet. Darüber hinaus enthielten viele Promotoren, mit oder ohne TATA-Box, eine pyrimidinreiche Initiator-Sequenz, die direkt über dem Transkriptionsstart lag (ROEDER, 1996). Ein Initiator-Element wurde erstmals von SMALE und BALTIMORE (1989) am Beispiels des Gens der murinen terminalen Desoxyribonucleotidyltransferase (TdT) beschrieben und besaß die nur sehr schwache Konsensussequenz YYAYTCYY (DU et al., 1993). Allgemein konnten Promotoren von eukaryontischen Genen in solche eingeteilt werden, bei denen das core-Promotor-Element eine TATA-Box enthielt, und in solche ohne TATA-Box. Die Promotoren vieler Haushaltsgene enthielten Initiatorelemente, jedoch keine TATA-Box, und erschienen auf Grund mehrerer Bindestellen für den Transkriptionsfaktor (TF) Sp1 G/C-reich (DYNAN und TJIAN, 1983; MELTON et al., 1986; VIHINEN et al., 1996). Die Initiation der Transkription konnte bei diesen Promotoren an verschiedenen Stellen erfolgen (MELTON et al., 1986). Der Promotorbereiche des humanen La/SS-B-Gens besaß eine Größe von 239 bp (Tabelle 2). GRÖLZ (1998) suchte mit dem Programm HUSAR (3.17) den Promotorbereich des humanen La/SS-B-Gens nach Promotorelementen und potentiellen TF-Bindestellen ab. Dabei fand sich keine TATA-Box, dafür aber eine GC-reichen Region. Stromaufwärts des humanen Exon 1 lagen eine CAAT-Box, eine SP1-Bindestelle und direkt stromabwärts davon eine AP2-Bindestelle. Ein 17 Nukleotide langer Bereich wurde auf Grund von Sequenzvergleichen mit Promotoren anderer Gene nach CHAMBERS et al. (1988) als G/C-reiches Promotorelement bezeichnet. Im Exon 1 selbst lag eine weitere AP2-Bindestelle. Auch der Promotorbereiche des murinen La/SS-B-Gens, der eine Größe von 527 bp besaß (Tabelle 2) und sich stromaufwärts des Exon 1a bzw. Exon 1b befand, wurde mit dem Programm HUSAR (3.17) nach Promotorelementen und TF-Bindestellen abgesucht. Nur die gängigsten TFs sind in Abb. 27 dargestellt und im Folgenden kurz beschrieben. Es fanden sich eine CCAAT-Box und mehrere davon abweichende Bindestelle, an die der CCAAT-binding factor oder der CTF (= CCAAT-Box-factor = nuclear factor-1 = NF-1) binden konnten. CCAAT-bindende Proteine fungierten als Aktivatoren der Promotor-Grundfunktion und als Regulationselemente (KNIPPERS, 1997). Feststellen ließen sich auch Bindestellen für TFIIA, TFIIA-α/β precursor (major), TFIIA-α/β precursor (minor), TFIIA-γ, TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIF-α, TFIIF-β und TFIID. TFIID spielte eine besondere Rolle beim Aufbau des Transkriptionskomplexes (KNIPPERS, 1997). Bindestellen für TBP, TBP-1 und TBF1 ließen sich ebenfalls detektieren. Von Bedeutung war das Vorhandensein von GC-Boxen, die besonders häufig in Promotoren von TATA-Box-freien Haushaltsgenen vorkamen und an die das Glykoprotein Sp1 (GC-Box-Protein) band. Sp1 sorgte zusammen mit TAF für die richtige Plazierung von TFIID im Bereich des Transkriptionsstarts (KNIPPERS, 1997). Des weiteren fanden sich Bindestellen für c-Myc und E2F-1, das eine zentrale Rolle bei der Regulation der Genaktivität im Verlauf des Zellzyklus einnahm (KNIPPERS, 1997). Interessanterweise ließen
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