verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

II
Verzeichnisse
4.4 Anlegen bakterieller Glycerin-Kulturen ...........................................................................................33
4.5 Schnelle Plasmid-Mini-DNA-Präparation........................................................................................34
4.6 Plasmid-Midi-DNA-Präparation.......................................................................................................34
4.7 Aufbewahrung von DNA .................................................................................................................34
4.8 Saure, ethanolische Fällung von Nukleinsäuren ............................................................................35
4.9 Gelelektrophorese von Nukleinsäuren ...........................................................................................35
4.9.1 DNA-Agarosegele .....................................................................................................................35
4.9.2 RNA-Agarosegele .....................................................................................................................36
4.10 Nachweis von Nukleinsäuren in Agarosegelen ............................................................................36
4.11 Quantifizierung von Nukleinsäuren...............................................................................................37
4.12 Elution von Nukleinsäuren aus Agarosegelen..............................................................................37
4.13 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen.........................................................................38
4.14 Ligation von DNA-Molekülen ........................................................................................................38
4.14.1 Gerichtete Klonierung .............................................................................................................39
4.14.2 T/A-Klonierung von PCR-Fragmenten ....................................................................................39
4.15 Herstellung kompetenter E. coli-Bakterien ...................................................................................39
4.16 Transformation kompetenter E. coli-Bakterien.............................................................................40
4.17 DNA-Sequenzierung.....................................................................................................................40
4.18 Polymerase-Ketten-Reaktion........................................................................................................41
4.19 Reinigung von PCR-Produkten.....................................................................................................42
4.20 RT-PCR ........................................................................................................................................43
4.21 5’-RACE........................................................................................................................................43
4.22 Genome walking ...........................................................................................................................44
4.23 Zu beachtende Arbeitsbedingungen bei Arbeiten mit RNA ..........................................................45
4.24 RNA-Isolierung aus Zellkulturen und Geweben............................................................................45
4.25 Northern-Blotting...........................................................................................................................46
B) Zellbiologische Arbeitsmethoden........................................................................................................47
4.26 Zu beachtende Arbeitsbedingungen bei Eukaryontenzellen.........................................................47
4.27 Kultivierung von Eukaryontenzellen..............................................................................................47
4.28 Gefrierkonservierung und Auftauen von Eukaryontenzellen ........................................................48
4.29 Herstellung von Proteinextrakten aus Eukaryontenzellen ............................................................48
4.30 Bestimmung der Zellzahl von Eukaryontenzellen.........................................................................48
4.31 Transiente Transfektion von Eukaryontenzellen ..........................................................................49
4.32 Immunzytochemische Fluoreszenzfärbung ..................................................................................49
4.33 In situ-Hybridisierung ....................................................................................................................50
4.34 Mikroskopiertechniken..................................................................................................................51
C) Proteinbiochemische Arbeitsmethoden..............................................................................................51
4.35 Bakterielle Expression von His-tag-Fusionsproteinen ..................................................................51
4.36 Affinitätsreinigung von His-tag-Fusionsproteinen .........................................................................52
4.37 Photometrische Bestimmung von Proteinkonzentrationen...........................................................53
4.38 Diskontinuierliche SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese...........................................................53
4.39 Färbung von SDS-Gelen mit Coomassie-Brillant-Blau.................................................................54
4.40 Western-Blotting ...........................................................................................................................54
4.41 Immundetektion von Proteinen.....................................................................................................54
4.42 Nachweisreaktion mit dem NBT-X-Phosphat-(BCIP-) System.....................................................55
4.43 Nachweisreaktion mit dem ECL-System ......................................................................................55
4.44 Antikörper-Elution .........................................................................................................................56
4.45 Hochauflösende, zweidimensionale Gelelektrophorese...............................................................56
4.46 In vitro-Transkription/-Translation.................................................................................................57
4.47 Immunisierung von Mäusen .........................................................................................................58
4.48 Gewinnung von Blut aus Mäusen .................................................................................................58
4.49 ELISA............................................................................................................................................59
5 ERGEBNISSE.........................................................................................................................................61
A) Untersuchung des murinen La/SS-B-Strukturgens ............................................................................61
5.1 Sequenzierung des Gens ...............................................................................................................61
B) Untersuchung der murinen La/SS-B-mRNAs bzw. La/SS-B-cDNAs..................................................65
5.2 Northern-Blotting.............................................................................................................................65
5.3 In situ-Hybridisierung ......................................................................................................................65
5.4 Expressionsanalyse der mRNA-Isoformen.....................................................................................67
5.5 Translationsanalyse der mRNA-Isoformen.....................................................................................73
5.5.1 Klonierung der eukaryontischen Expressionsvektoren .............................................................74
5.5.2 Transiente Transfektion ............................................................................................................75
5.5.3 In vitro-Transkription/-Translation .............................................................................................76
5.6 Lokalisationsanalyse des murinen La/SS-B-Proteins bei transienter Überexpression...................78