verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

4 Methoden 59
Zentrifugation bei 16000 g für 30 min, um Zellen und feste Serumbestandteile zu pelletieren. Der
Serumüberstand konnte bei –20°C gelagert werden.
4.49 ELISA
Der ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) eignete sich zum Nachweis von Serum-AK, die
gegen bestimmte Antigene gerichtet waren. Die verwendeten Träger bestanden aus Kunststoff (Polystyrol
und Polyvinylchlorid) (CATT und TREGEAR, 1967), an den Antigene nicht kovalent gebunden wurden
(MILES und HALES, 1968; SILMAN und KATCHALSKI, 1966). Bei einem indirekten ELISA wurden die
Serum-AK an das immobilisierte Antigen gebunden und mittels eines Enzym-markierten Sekundär-AK
detektiert (ENGVALL und PERLMANN ,1971; VAN WEEMEN und SCHUURS, 1971). Die
Detektionsgrenze des ELISA lag bei 0,01 bis 0,1 ng Protein (HARLOW und LANE, 1988). Die Sensitivität
war abhängig von der Menge des Antigens und der Avidität der Primär-AK. Die Platten wurden mit
Proteinkonzentrationen von 0,25 bis 0,5 µg beschichtet. Zuviel an Protein führte zur Ablösung von der
Platte und Störung des Nachweises (HARLOW und LANE, 1988). Verdünnungen wurden in 1x PBS
(0,8 mM Na 2 HPO 4 ; 0,1 mM KH 2 PO 4 ; 0,14 mM NaCl; 0,26 mM KCl; pH 7,4) angesetzt. Alle
Inkubationsschritte wurden in einer feuchten Kammer durchgeführt.
Pro Vertiefung wurden 50 µl der jeweiligen Antigenverdünnung in die Mikrotiterplatte pipettiert. Die
optimale Antigenkonzentration wurde vorher in einer Verdünnungsreihe ermittelt. Die Kopplung der
Proteine an die Platte erfolgte für 1 h bei 37°C. Im Anschluss wurde 3mal mit je 150 µl 1x PBST (1xPBS
mit 0,1% [v/v] Tween 20) gewaschen. Um unspezifische Reaktionen zu vermeiden, mussten
freigebliebene Bindestellen mit je 150 µl einer 1,5%igen BSA-Lösung (in 1x PBS) für 1 h bei RT inkubiert
werden. Nach 3maligen Waschen mit je 150 µl 1x PBST wurden 50 µl des zu testenden Serums in die
Vertiefungen pipettiert und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die optimale Serumkonzentration wurde vorher in
einer Verdünnungsreihe (1:10 bis 1:10000) ermittelt. Schließlich wurde 3mal mit je 150 µl 1x PBST
gewaschen und die Mikrotiterplatte anschließend mit je 50 µl des mit 1x PBS 1:10000 verdünnten
Sekundär-AK anti-Maus-IgG POD-Konjugat (3.13) beschichtet. Die Inkubation erfolgte für 1 h bei 37°C.
Es folgte ein 3maliges Waschen mit je 150 µl 1x PBST und aqua dest..
Die Detektion der AK erfolgte mittels eines Systems, das sich aus den Komponenten
o-Phenylendiamin (OPD) und Wasserstoffperoxid zusammensetzte (VOLLER et al., 1979). Die an den
Sekundär-AK gebundene Peroxidase katalysierte in Gegenwart von H 2 O 2 die Umsetzung von OPD zu
gelbbraunem 1,2-Dinitrophenol. Pro Vertiefung wurden 50 µl OPD-Substratlösung (15 mM OPD; 0,05%
[v/v] H 2 O 2 ; 50 mM Na 2 HPO 4 ; 25 mM Citrat; pH 5,0) pipettiert. Im Anschluss inkubierte die Platte 15 min
unter Lichtausschluß bei 37°C. Danach wurde die Färbereaktion durch Zugabe von je 25 µl einer 4,5 M
H 2 SO 4 -Lösung beendet. Die Auswertung der Farbreaktionen erfolgte qualititativ und quantitativ mit einem
Photometer bei 492 nm.