verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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5 Ergebnisse
5.12.2 Nachweis von Autoantikörpern durch Immuno-Blotting
Um die Reaktivitäten der Maus-Seren im Immuno-Blot zu überprüfen, wurden jeweils
25 µg der bakteriellen Proteine rek. hLa, rek. hLa-N(7A), rek. hLa-N(9A), rek. hLa-C (3.19) und
rek. mLa (5.9) auf ein 10%iges SDS-Gel aufgetragen, durch SDS-PAGE (4.38) aufgetrennt und
durch Western-Blotting auf eine PVDF-Membran transferiert (4.40). Die Immundetektion (4.41)
der immobilisierten La/SS-B-Proteine erfolgte mit den gewonnen Maus-Seren (5.12). Der
indirekte Nachweis der AK-Protein-Komplexe erfolgte durch ein Gemisch bestehend aus einem
mit AP konjugierten anti-Maus-IgG-Sekundär-AK (3.13) und einem mit AP konjugierten
anti-Maus-IgM-Sekundär-AK (3.13). Der anti-Maus-IgM-Sekundär-AK wurde zusätzlich
verwendet, um auch IgM in den Seren nachweisen zu können. In manchen Fällen konnten trotz
mehrmaliger Immunisierungen keine IgG induziert werden. Die verwendete Sekundär-AK
waren bereits dahingehend getestet worden, dass sie keine Kreuzreaktivitäten zeigte. Die
Detektion erfolgte durch das NBT-/X-Phosphat-System (4.42).
Im Immuno-Blot zeigte keines der Seren Reaktivität zu den Proteinen bzw.
Proteinfragmenten. Dies lag vermutlich daran, dass die Proteine durch die SDS-PAGE
denaturiert wurden. Im ELISA (5.12.1) wurden nur Proteine eingesetzt, die unter nativen
Bedingungen gewonnen wurden. Dies ließ den Schluß zu, dass die Serum-AK ausschließlich
Konformationsepitope erkennen konnten.
5.12.3 Nachweis von Autoantikörpern durch immunzytochemische Färbung
Um die Hypothese zu bestätigen, dass die Serum-AK nur native Proteine detektierten,
wurde die Reaktivität der Maus-Seren in immunzytochemischen Färbungen (4.32) auf murinen
NIH-3T3-Zellen getestet. Den ELISA-Ergebnissen zufolge war zu erwarten, dass die Seren die
endogenen, murinen La/SS-B-Proteine detektierten.
Zur Immunfärbung wurden NIH-3T3-Zellen in Methanol/EGTA fixiert (4.32). Diese Art
der Fixierung führte zu keiner Veränderung der Proteinstrukturen. Die fixierten Zellen wurden
anschließend mit den Maus-Seren inkubiert (4.32). Das Serum einer Balb/c-Maus, das vor den
Immunisierungen abgenommen wurde (5.12), diente dazu, das Vorhandensein von
Autoantikörpern auszuschließen. Der Nachweis der Antigen-AK-Komplexe erfolgte mit einem
mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 markierten anti-Maus-AK (3.13). Dieser Sekundär-AK
detektierte alle Subklassen muriner AK. Laborerfahrungen zufolge konnten Kreuzreaktivitäten
des Sekundär-AK ausgeschlossen werden. Die Bilder der Immunfluoreszenzfärbungen sind in
Abb. 25 dargestellt.
Wie in Abb. 25 zu erkennen war, lieferten alle Seren eine nukleäre Färbung, wie sie für
das La/SS-B-Protein typisch war. Das Serum einer Balb/c-Maus, das vor den Immunisierungen
abgenommen wurde, lieferte keinerlei Färbung. Die Ergebnisse der immunzytochemischen