verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

5 Ergebnisse 61
5 ERGEBNISSE
A) Untersuchung des murinen La/SS-B-Strukturgens
5.1 Sequenzierung des Gens
Ziel der Sequenzierung war es, das vollständige murine La/SS-B-Strukturgen zu
erhalten, um z.B. Rückschlüsse auf die Expression der murinen La/SS-B-mRNAs ziehen zu
können. Von TOPFER et al. (1993) war eine murine La/SS-B-cDNA-Sequenz veröffentlicht
worden (GenBank accession No. L00993), die als Vorlage zur Konstruktion von Exonspezifischen
Primern diente, mit denen die Introns von genomischer DNA einer weiblichen
129/SvEvTACfBr-Maus (3.11) durch PCR (4.18) amplifiziert werden sollten. Da beim humanen
La/SS-B-Gen die Exon-Intron-Übergänge bekannt waren (GRÖLZ, 1998) (8.1 und Tabelle 2
und 3), diente die humane Sequenz dazu, die splice-Stellen in der murinen La/SS-B-cDNA
vorauszusagen, um die Lage der Exon-spezifischen Primer zu optimieren und diese nicht über
eine splice-Stelle zu legen. Für jedes Intron sollte ein passendes Primerpaar gefunden werden,
wobei ein Intron mit einem nach 3’-gerichteten Primer im Exon auf dessen 5’-Seite und einem
nach 5’-gerichteten Primer im Exon auf dessen 3’-Seite amplifiziert werden sollte. Dies war
auch größtenteils möglich. Einige Introns ließen sich jedoch nicht auf diese Weise amplifizieren.
Solche Introns wurden mittels des genome walking (4.22) erhalten, einer Methode zur
Amplifizierung unbekannter 5’-Enden einer genomischen DNA-Sequenz durch PCR. Hierbei
war es notwendig, die Spezifität der ersten PCR-Reaktion durch eine zweite (nested-PCR) zu
erhöhen, bei der die nested-Primer innerhalb der Sequenz des ersten PCR-Produktes lagen.
Als Grundlage für die Sequenzierung des murinen La/SS-B-Gens dienten die durch PCR
amplifizierten Intron-Fragmente (Abb. 4), die in den PCR-Klonierungsvektor pGEM-T (3.10)
durch T/A-Klonierung einkloniert wurden (4.14.2).
Abb. 4: Agarosegel der genomischen PCR des murinen La/SS-B-Gens