verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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Abb. 14: Klonierungsschema der murinen dicistronen CAT-La/SS-B-cDNA-Konstrukte
Grundlage zur Herstellung eines Kontrollkonstrukts war der Klon pcDNA3-La-Murin
(Exon 2-11) (5.5.1), dessen La/SS-B-Insert mit dem Start-AUG im Exon 2 begann und am
3’-Ende mit dem Stop-Codon endete und somit nur den codierenden Leserahmen ohne die
alternativen 5’-Anfänge enthielt. Das Konstrukt pcDNA3-La-Murin (Exon 2-11) wurde mit den
Restriktionsenzymen EcoR I und Not I verdaut, da dies die unter 5.5.1 verwendeten Primer auf
Grund der artifiziellen Restriktionsschnittstellen zuließen. Die herausgeschnittene cDNA wurden
in den Vektor pCI einkloniert, der mit den Enzymen EcoR I und Not I verdaut worden war,
wobei das Konstrukt pCI-La-Murin (Exon 2-11) (Abb. 14) entstand.
Als Ausgangskonstrukt für die Herstellung des CAT-Leserahmens diente der Vektor
CAT-Basic (3.10). Die PCR (4.18) zur Amplifizierung der CAT-cDNA wurde mit den Primern
CAT-Vor und CAT-Rück (3.20) durchgeführt. Die amplifizierte CAT-cDNA besaß eine Größe
von 648 bp. Die Primer wurden so gewählt, dass die CAT-cDNA mit dem Start-AUG begann
und mit dem Stop-Codon endete. Die CAT-cDNA wurde durch T/A-Klonierung in den
PCR-Klonierungsvektor pGEM-T (3.10) einkloniert. Der CAT-Vorwärtsprimer besaß an seinem
5’-Ende eine artifizielle Nhe I-Restriktionsschnittstelle und der CAT-Rückwärtsprimer eine
artifizielle Xho I-Restriktionsschnittstelle. Dadurch konnte die CAT-cDNA mit diesen beiden
Enzymen herausgeschnitten und in die zuvor hergestellten pCI-Konstrukte einkloniert werden,
die ebenfalls mit den Restriktionsenzymen Nhe I und Xho I verdaut worden waren. Die Nhe I-
und Xho I-Restriktionsschnittstellen waren im Vektor pCI so gelegen, dass die CAT-cDNA vor