verzeichnisse - ArchiMeD - Johannes Gutenberg-Universität Mainz

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4 Methoden
4.13 Verdau von DNA mit Restriktionsendonukleasen
COHEN et al. (1973) beschrieben zum ersten Mal die Möglichkeit, DNA unterschiedlicher
Herkunft mittels Restriktionsendonukleasen zu schneiden und über kohäsive Enden miteinander zu
ligieren. Auf diese Weise konnte Fremd-DNA in Plasmidvektoren eingebaut und in Bakterien vermehrt
werden. Restriktionsenzyme von Bakterien erkannten kurze Folgen von palindromischen Nukleotiden und
schnitten die DNA entweder direkt an (Typ II) oder versetzt (Typ I und Typ III) von ihrer
Erkennungssequenz. Die zelleigene DNA der Prokaryonten wurde vor dem Abbau durch Modifikation der
Erkennungssequenzen (Methylierung) geschützt (STRYER, 1991). Dieses Restriktionssystem diente dem
Schutz vor Fremd-DNA, z.B. vor Bakteriophagen (KNIPPERS, 1997). Bei Reaktionsansätzen zum Verdau
von Plasmid-DNA mit Restriktionsenzymen wurden 0,5-1,5 µg DNA in einem Gesamtvolumen von 30 µl
bei 37°C für 3-4 h geschnitten. Die Enzyme wurden in einer Konzentration von 3-5 U/µg Plasmid-DNA
eingesetzt. Bei allen Restriktionsverdauen nahm das Enzymvolumen nur maximal 10% des
Gesamtvolumens ein, da das den Enzymen zugesetzte Glycerin die Enzymreaktion störte. Nach
Beendigung der Inkubationszeit konnte die Reaktion bei den meisten Enzymen durch Hitzeinaktivierung
bei 60-65°C für 20 min abgestoppt werden. Das sich während der Inkubation bei 37°C mit der Zeit am
Deckel des Reaktionsgefäßes ansammelnde Kondenswasser wurde 2mal/h abzentrifugiert, um die
Salzkonzentration konstant zu halten. Die im Labor verwendeten Restriktionsenzyme erzeugten glatte
Enden oder schnitten die DNA an versetzten Stellen, so dass ein Überhang eines der beiden
DNA-Stränge entstand. Auf diese Weise ließen sich durch den Verdau zweier verschiedener DNAs mit
demselben Enzym kohäsive, d.h. zueinander passende Enden erzeugen. Dies wurde für Klonierungen
genutzt, denn an diesen komplementären Stellen lagerten sich die DNA-Bruchstücke bevorzugt
zusammen (COHEN et al., 1972).
4.14 Ligation von DNA-Molekülen
Zur Verknüpfung von Fremd-DNA und linearisiertem Plasmid wurde das Ligations Kit (3.5)
verwendet. Die T4-DNA-Ligase (aus T4-Phage) bildete unter ATP-Verbrauch Phosphodiesterbindungen
zwischen der freien 3'-OH-Gruppe des einen und der 5'-Phosphatgruppe des anderen Fragments
(STRYER, 1991). Der Ligations-Reaktionsansatz umfasste ein Volumen von 10 µl und enthielt 50 ng
linearisierte Vektor-DNA sowie Insert-DNA in einem molaren Verhältnis von 2:1 bis 10:1 (Insert-Enden :
Vektor-Enden), 1 U T4-DNA-Ligase und 1 µl 10x Ligationspuffer. Die Inkubation erfolgte für 24-48 h bei
4°C, obwohl das Temperaturoptimum der Ligase bei 37°C lag. Jedoch waren bei dieser Temperatur die
Wasserstoffbrückenbindungen der gepaarten DNA-Enden instabil. Die einzusetzende Insert-DNA-Menge
ließ sich nach folgender Formel berechnen (SAMBROOK et al., 1989):
Vektor-DNA [ng] x Größe d. Insert-DNA [kb]
Insert-DNA [ng] = x gew. Verh. Insert-Enden
Größe des Vektors [kb]
Vektor-Enden
wobei das gewünschte Verhältnis (gew. Verh.) von der Art der Klonierung abhing. Bei einer gerichteten
Klonierung (4.14.1) wurde ein Verhältnis von 2:1, bei einer T/A-Klonierung (4.14.2) ein Verhältnis von bis
zu 10:1 (Insert-Enden : Vektor-Enden) gewählt.