Variedades Regionais e Agricultura Biológica - DRAP Centro

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em macieira, designadamente RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Nybom & Schaal, 1990; Watillon et al., 1991), RAPD (Koller et al., 1993; Mulcahy et al., 1993; Harada et al., 1993; Dunemann et al., 1994; Gardiner et al., 1996; Goulão et al., 2001), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (Goulão et al., 2001) and SSR (Simple Sequence Repeats) (Guilford et al., 1997; Gianfranceschi et al., 1998), implicam a realização de estudos comparativos com o objectivo de seleccionar a melhor tecnologia de marcadores molecular para ser utilizada em análise de diversidade genética, considerando a reprodutibilidade, custos, sensibilidade e nível de detecção dos polimorfismos. O principal objectivo deste estudo foi testar a capacidade da técnica RAPD para avaliar o nível de semelhança genética existente entre variedades regionais de macieira. Os dados obtidos neste estudo permitirão num futuro próximo avaliar as eventuais sinonímias existentes, designadamente no pomar experimental da DRAPC (Viseu). Será igualmente realizada uma bulked segregant analysis (BSA) descrita por Michelmore et al. (1991) considerada uma ferramenta útil para identificar marcadores ligados a um gene de interesse, através da criação de uma pool de ADN de um conjunto de genótipos que possuem em comum uma característica morfológica ou relacionada com resistência a uma doença. A importância do estudo destas variedades regionais, prende-se com a necessidade de considerar a eventualidade de introduzir comercialmente novas variedades com características organolépticas e físico-químicas interessantes sob o ponto de vista do consumidor, bem como a obtenção de elevados índices de produtividade e resistência sob o ponto de vista fitossanitário com vantagens para a fileira produtiva. Material e Métodos Material Vegetal Este estudo foi realizado em 13 variedades regionais de macieira da colecção da DRAPC (Viseu). A origem e o nível de ploidia de cada variedade são apresentados no quadro 1. Quadro 1. Variedades regionais de macieira usadas neste estudo. CÓDIGO VARIEDADE PROVENIêNCIA NÍVEL PLOIDIA BE Bravo Viseu 2n CA Camoesa Alcangosta Castelo Branco 2n CD Comendador Viseu 2n CR Camoesa Rosa Alcobaça 2n D Durázio Viseu 2n MG Malápio de Gouveia Guarda 2n MIFEC Malápio do IFEC IFEC 2n PB Pipo Basto Viseu 2n PL Pardo Lindo IFEC 2n PP Piparote Viseu 2n PR Pêro Rei Bragança 2n TB Tromba de Boi Coimbra 2n VB Verdeal de Bodiosa Viseu 2n IFEC – Instituto de formação e Educação cooperativa de Moimenta da Beira - Fundação Rodrigues da Silveira. Coordenadas do Campo experimental de Viseu; Lat 40º39’49’’N; Long 07º54’02’’W; Alt - 453 m 40
Extracção aDN O ADN de todas as cultivares analisadas foi extraído de folhas frescas, jovens completamente expandidas. A extracção de ADN para a análise RAPD foi realizada a partir de 100 mg de folhas de cada variedade usando o Dneasy Plant Mini Kit (QIAGEN Inc) de acordo com as indicações do fabricante. As extracções do ADN foram posteriormente armazenadas a -20ºC até serem utilizadas. A concentração do ADN e a determinação da qualidade foi avaliado por espectrofotometria (PerkinElmer Lambda 25). O ADN foi diluído com água estéril para uma concentração final de 12,5 ng/µl. análise raPD A análise RAPD por PCR foi realizada em volumes de 25 µl contendo 25 ng de ADN genómico, 0,4 µM de primer, 1 unidade de Taq DNA polymerase (Roche), 0,2 mM de cada dNTP (Roche), 10 mM Tris HCl, (pH 8,3), 50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2. As reacções de amplificação realizaram-se num termociclador UNO II (Biometra), com a seguinte programação: etapa inicial para desnaturação de 90 seg a 94ºC, 35 ciclos de 30 seg a 94ºC (desnaturação), 30 seg a 36ºC (emparelhamento) e 60 seg a 72ºC (extensão), seguido de 10 min a 72ºC, para uma extensão final de cadeias simples. Foram testados 50 primers dos Kits OPB (20), OPC (9), OPD (1) e OPI (20) (Operon Technologies, Alameda Calif.) Cada reacção de amplificação foi desenvolvida utilizando apenas um primer e repetida para verificar a reprodutibilidade dos resultados. Os fragmentos de ADN obtidos após a amplificação foram separados por electroforese em géis de agarose 1,4% (Invitrogen) usando 1X TBE (Invitrogen), corados por brometo de etídeo (Bio-Rad) e visualizados e fotografados num sistema digital de visualização, análise e documentação Gel Doc 2000 (Bio-Rad). Os marcadores moleculares utilizados para estimar o peso molecular dos produtos amplificados foram 100 pb e 1Kb (Bio-Rad). análise NtSYS Os fragmentos RAPD obtidos em todas as variedades com cada primer foram numerados (1,2,3,…n) por ordem decrescente do peso molecular. Apenas foram considerados os produtos de amplificação claros e distintos, não sendo considerados diferenças na intensidade das bandas entre perfis de amostras distintas. Cada fragmento foi tratado como uma unidade de carácter e assinalado como presente (1) ou ausente (0) para cada variedade e os dados introduzidos numa matriz de dados binário. As semelhanças entre as variedades foram analisadas usando o coeficiente Jaccard e a análise cluster foi executada para construir o dendrograma, usando UPGMA, a partir da matriz de semelhança. Todas as análises foram realizadas usando o software NTSYSpc (Version 2.02f, Rohlf 1998). A robustez do dendrograma obtido com os fragmentos RAPD foi testado pela análise bootstrap com 1000 replicações através do programa FreeTree (Pavlicek et al., 1999). Neste estudo, foi utilizado o limite de 50% para testar o agrupamento das variedades para ser estatisticamente significativo (Capo-chichi et al., 2001). 41 Capítulo 1 - Variedades regionais portuguesas
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