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DISKUSSION
Blot-Analyse und Radioimmunpräzipitation nachgewiesen werden. Durch die
Expression in pro- und eukaryontischen Systemen wurde demonstriert, dass ähnlich
wie für die Heparanase [Goldshmidt, 2001] der porcine CD40L ohne Signal-Anker-
Sequenz als lösliches Protein und mit Signal-Anker-Sequenz als membranständiges
Molekül exprimiert wird.
Die cDNA des porcinen IL-18 wurde mittels RT-PCR hergestellt. Anschließend
gelang es, das porcine IL-18 als Hexahistidinfusionsprotein im pQE-E.coli-
Expressionssystem zu exprimieren [Oem, 2000] und durch Affinitätschromatographie
aufzureinigen. Das gereinigte Protein konnte zur Herstellung eines spezifischen
polyklonalen IL-18 Antiserums verwendet werden.
Die IL-18-Expression der hergestellten stabilen 293-IL-18-Zelllinie konnte über
Western Blot-Analyse und Radioimmunpräzipitation nachgewiesen werden.
Überraschenderweise wurden im Western Blot große Mengen des unter
Normalbedingungen sekretierten Proteins intrazellulär detektiert. Anders als viele
Zytokine [Cosman, 1987] enthält IL-18 keine RNA-destabilisierenden Elemente und
liegt dadurch länger als andere Zytokine in seiner inaktiven Vorläuferform [Muneta,
2001; Ghayur, 1997] in der Zelle vor [Gu, 1997; Okamura, 1995]. Die intrazelluläre
Anhäufung des Proteins deutet auf eine verhältnismäßig starke Expression oder
geringere Prozessierungsaktivität durch die 293-Zellen hin.
Bedingt durch die heterodimere Molekülstruktur des IL-12 mussten die beiden
Untereinheiten durch zwei getrennte Plasmide in E.coli exprimiert werden. Für die
p40-Untereinheit des IL-12 wurde wie für den CD40L ausschließlich nach Entfernung
einer 30 AS langen hydrophoben N-terminalen Sequenz ein spezifisches
Translationsprodukt detektiert, dessen Solubilisierung als Hexahistidinfusionsprotein
allerdings weder mit nativen noch denaturierenden Reinigungsprotokollen gelang. Die
im Vergleich zu nicht induzierten Kulturen immensen Proteinmengen ermöglichten
eine Reinigung der p40-Untereinheit über präparative PAA-Gele.
Bei der Expression der p35-Untereinheit zeigten sich vergleichbare Probleme wie bei
der Expression der p40-Untereinheit. Die Analyse der zweidimensionalen Struktur der
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