PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

METHODEN
Coomassie-Färbelösung: 0,1% Coomassie Brillant Blue, 10% Essigsäure,
30% Ethanol
Fixierlösung 10% Essigsäure, 30% Ethanol
6.6.4 Silberfärbung von Proteinen
Proteine geringer Konzentration, die durch eine Färbung mit Coomassie Brillant Blue
nicht detektiert werden konnten, wurden mit Silber gefärbt. Die Silberfärbung erfolgte
mit dem Bio-Rad Silver Stain Kit entsprechend den Angaben des Herstellers.
6.6.5 Detektion [ 35 S]-markierter Proteine
Die Detektion von [ 35 S]-markierten Proteinen, die in der SDS-PAGE aufgetrennt
wurden, erfolgte über Autoradiographie. Die Gele wurden nach der Elektrophorese für
30 min in Fixierlösung inkubiert, danach für 30 min in En 3 Hance geschwenkt,
anschließend für 2x 10 min gewässert, getrocknet und auf einem Röntgenfilm
exponiert.
6.6.6 Western Blot Analyse
Der Transfer der elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf Nitrozellulose erfolgte
nach dem „semi-dry“-Verfahren mit der Trans-Blot SD-Apparatur der Firma Bio-Rad.
Entsprechend den Angaben des Herstellers wurden Minigele für 30 min bei 10 V in
geblottet. Anschließend wurde die Nitrozellulose zur Absättigung unspezifischer
Bindungsstellen für 30 min in TBS mit 3% BSA geschwenkt. Die Inkubation mit dem
ersten Antiserum (Verdünnung in TBS-T) erfolgte über Nacht bei 4°C oder für
mindestens 2 h bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen der Membran für 3x 15 min
in TBS-T wurde der zweite, mit Alkalischer Phosphatase (AP) -konjugierter
Antikörper (Verdünnung 1:7500 in TBS-T) zugegeben und 2 h bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach dreimaligem Waschen für je 15 min in TBS-T wurde die Membran
kurz in AP-Puffer geschwenkt und anschließend gefärbt. Die Färbereaktion erfolgte
für 5-20 min in 10 ml AP-Puffer mit 66 µl NBT-Stocklösung und 33 µl BCIP-
Stocklösung. Die Reaktion wurde durch eine 5minütige Inkubation der
120