PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

ERGEBNISSE
Trotz Sequenzüberprüfung und Optimierung der Induktionsbedingungen gelang es
nicht zweifelsfrei (Vergleich induzierte/ nicht induzierte Kulturen), in Coomassie-
gefärbten PAA-Gelen eine Expression der p35-Untereinheit im Gesamtzelllysat zu
detektieren. Weder eine GST-spezifische Reinigung über Glutathione-Sepharose noch
eine Hexahistidin-spezifische Reinigung über Ni 2+ -NTA-Agarose erbrachten ein
spezifisches Produkt. Da uns kein p35-spezifisches Antiserum zur Verfügung stand,
blieb als Option nur die Detektion eines möglichen Produktes durch GST- bzw.
Hexahistidin-spezifische Antiseren. Deshalb wurden Gesamtzelllysate von induzierten
und nicht induzierten Kulturen im Western Blot mittels GST- bzw. Hexahistidin-
spezifischer Antiseren untersucht. p35-spezifische Signale (p35-GST-Hexahistidin-
Fusionsprotein hat eine Größe von 64 kDa (35 kDa (p35) + 29 kDa (GST)) konnten
sowohl für die GST- (Abb. 3-31 A) als auch für die Hexahistidin-spezifischen
Antiseren (Abb. 3-31 B) in induzierten Kulturen nachgewiesen werden.
Abb. 3-31: Western Blot-Analyse der rekombinanten porcinen p35-Untereinheit des IL-12.
Zur Überprüfung der Expression des p35-GST-Hexahistidin-Fusionsproteins wurde Gesamtzelllysat
gelelektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit GST- (A) und Hexahistidinspezifischen
(B) Antiseren analysiert. Als Negativkontrolle fungierte Zelllysat nicht
induzierter E.coli-Kulturen (-). Die induzierten Kulturen sind durch (+) gekennzeichnet. Das
p35-GST- und Hexahistidin-Fusionsprotein hat eine Größe von 64 kDa (35 kDa (p35) + 29
kDa (GST)). Relevante Größen des Protein–Längenstandards sind jeweils am linken Bildrand
bezeichnet.
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