PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

Transfektionsmethoden
METHODEN
• Für transiente und stabile Transfektionen von Plasmid-DNA wurde nach
.
Abschätzung der Transfektionseffizienz hauptsächlich die Liposomen-vermittelte
Transfektion mittels Effectene angewandt.
Elektroporation:
2x10 6 Zellen wurden pelletiert (1000 rpm, 5 min), 2x in PBS gewaschen und in 100 µl
PBS aufgenommen. Nach Zugabe der zu transfizierenden DNA wurde die vorsichtig,
jedoch gut gemischte Zellsuspension in eine Elektroporationsküvette überführt. Die
Elektroporation erfolgte im Gene Pulser der Firma Bio-Rad für 293- wie MAX-Zellen
bei 25 µF und 800 V. Anschließend wurden die Zellen in Kulturschalen überführt
(∅=3,5 cm) und in entsprechendem Medium kultiviert.
• Kalziumphosphat-Transfektion:
Kalziumphosphat-Transfektionen wurden mit dem Mammalian Transfection Kit
(Stratagene) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Standardmäßig wurden auf
„6-well“-Platten ausgesäte Zellen transfiziert.
• Liposomen-vermittelte Transfektion:
Für die Liposomen-vermittelte Transfektion wurde das Effectene Transfektionsregenz
(Qiagen) nach Angaben des Herstellers eingesetzt.
6.2.1.5 Herstellung stabiler Zelllinien
Zur stabilen Integration von Plasmid-DNA in Eukaryotenzellen wurde diese vor der
Transfektion entsprechend den Angaben im Text mit einem geeigneten
Restriktionsenzym linearisiert. Für die Selektion von resistenten Klonen wurden die
Zellen einer 32 mm Kulturschale zwei Tage nach Transfektion auf insgesamt vier 100
mm Schalen umgesetzt und nachfolgend in Selektionsmedium kultiviert. Resistente
Einzelkolonien, die nach 2-4 Wochen zu sehen waren, wurden über
Klonierungszylinder isoliert. In der vorliegenden Arbeit wurden stabile Zelllinien des
pcDNA3-Expressionssystems hergestellt.
105