PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

ERGEBNISSE
Nach Transformation von E.coli mit den entsprechenden pQE-CD40L +/- -Plasmiden
wurden die Übernachtkulturen mit 0,8 mM IPTG induziert. Beim Vergleich von
induzierten und nicht induzierten Kulturen in Coomassie-gefärbten PAA-Gelen
konnten deutliche Mengen von rekombinantem CD40L - detektiert werden (Abb. 3-26
A). Für das CD40L + -Konstrukt war es nicht möglich, einen Nachweis der Expression
zu erbringen. Der rekombinante CD40L - wurde anschließend nativ bzw. denaturierend
mittels Affinitätschromatographie über Ni 2+ -NTA-Agarose aufgereinigt. Allerdings
konnten nur bei der denaturierenden Aufreinigung relevante Mengen an
rekombinantem Protein in Coomassie-gefärbten PAA-Gelen detektiert werden ( Abb.
3-26 B). Eine mögliche Ursache liegt in der Unzugänglichkeit des Hexahistidin-Endes
bei nativer Proteinfaltung, wodurch eine Bindung an die Ni 2+ -NTA-Agarose-Säule
erschwert wird.
Abb. 3-26: CD40L - -Expression als Hexahistidin-Fusionsprotein. A zeigt die Induktion des
CD40L - - Hexahistidin-Fusionsproteins. Gesamtzelllysat von induzierten (+) und nicht
induzierten (-) Kulturen wurde in einem 12,5%igem PAA-Gel aufgetrennt und mit Coomassie
gefärbt. In Abb. B ist das rekombinante porcine CD40L - nach denaturierender
affinitätschromatographischer Reinigung in einem Coomassie-gefärbten 12,5%igen PAA-Gel
dargestellt. Relevante Größen des Protein–Längenstandards sind jeweils am linken Bildrand
bezeichnet.
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