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METHODEN
• stabile Zelllinien des pcDNA3-Expressionssystems
Die Herstellung der für das pcDNA3-Expressionssystem benötigten stabilen Zelllinien
erfolgte entsprechend den Angaben des Herstellers (INVITROGEN).
Zusammengefaßt wurden hierbei folgende Schritte durchgeführt:
1. Transfektion der linearisierten pcDNA3 Plasmide über Effectene (1 µg Plasmid-
DNA)
2. Selektion der transfizierten 293-Zellen mit je 600 µg/ml G418
3. Analyse der isolierten Klone über Western Blot, Radioimmunpräzipitation und
Immunfluoressensanalyse
6.3 Allgemeine Arbeiten mit Nukleinsäuren
6.3.1 Spektrophotometrische Konzentrationsbestimmung
Die Konzentration und Reinheit von Nukleinsäuren in wässriger Lösung wurde
photometrisch bestimmt. Hierzu wurden UV-Absorptionsspektren im Wellenlängen-
bereich von λ=320-220 nm aufgenommen. Die Konzentration der Nukleinsäuren
errechnet sich aus der Extinktion bei λ=260 nm (OD260). Eine OD260 von 1,0 entspricht
dabei einer Konzentration von 50 µg/ml doppelsträngiger DNA, 33 µg/ml
einzelsträngiger DNA bzw. 40 µg/ml RNA. Aus dem Verhältnis der Absorptionswerte
bei 260 nm und 280 nm (OD260/OD280) läßt sich der Reinheitsgrad der Nukleinsäure
ableiten. Für reine DNA liegt dieser Ouotient zwischen 1,8 und 2,0, für reine RNA
zwischen 1,9 und 2,1.
6.3.2 Phenol/Chloroform-Extraktion
Zur Entfernung von Proteinen wurden wäßrige Nukleinsäure-Lösungen nacheinander
mit je einem Volumen Phenol, Phenol/Chloroform (1:1) und Chloroform
ausgeschüttelt. Für die Extraktion von DNA wurde eine Tris-gesättigte Phenollösung
(pH 7,6), für RNA eine H2O-gesättigte Phenollösung verwendet (pH 4,0). Um die
Trennung der Phasen zu beschleunigen und die Abnahme der wäßrigen Oberphase zu
erleichtern, wurden die ausgeschüttelten Fraktionen jeweils kurz zentrifugiert (1 min,
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