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ERGEBNISSE
Abb. 3-39: Klonierungsschema für das pGEX-E2-Expressionsplasmid. Die Konstruktion des
pGEX-E2-Plasmides erfolgte durch Subklonierung eines mit den Oligonukleotidprimern E2bak.seq/rev
durch PCR amplifizierten E2-Fragments, das mit den Restriktionsenzymen
BamH I/EcoR I verdaut und anschließend über diese Schnittstellen in den pGEX-E2-Vektor
ligiert worden war. Außer den Schnittstellen wurde durch die Primer zusätzlich ein
carboxyterminales Hexahistidin-Ende in das PCR-Fragment eingeführt.
Bei Induktion und anschließender Reinigung konnte weder mit GST- noch mit
Hexahistidin-Ende- spezifischen Reinigungsprotokollen eine zufriedenstellende
Produktausbeute in einem Coomassie-gefärbten PAA-Gel detektiert werden. Die
deshalb durchgeführte Western Blot-Analyse der Gesamtzelllysate mit verschiedenen
E2-spezifischen monoklonalen Antikörpern zeigte außer einem spezifischen Signal für
das unglykosylierte E2-GST-Fusionsprotein auch eine Reihe von spezifischen Abbau-
produkten, was unter Umständen die erfolglosen Reinigungsversuche erklären könnte
(Abb. 3-40). Das erhaltene E2-spezifische Signal hatte eine Größe von ca. 74 kDa (45
kDa (E2) + 29 kDa (GST)). Die beobachtete Größe des exprimierten E2 Glykoproteins
korreliert somit mit den Daten von Ruglli et al. (1995) für mittels Baculoviren
exprimiertem unglykosyliertem E2.
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