PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

6.12.3 Nichtfunktionelle Testsysteme
METHODEN
6.12.3.1 CSFV spezifischer Kompetitions-ELISA
Zum Nachweis von CSFV-spezifischen Antikörpern im Blutserum und -plasma von
Schweinen wurde ein Enzymimmuntest (CHEKIT-CSF-SERO) verwendet. Der Test
wurde nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
6.12.3.2 IgG1/IgG2-isotypspezifischer ELISA
Für den Nachweis von IgG1 und IgG2 CSFV spezifischen Antikörpern in porcinen
Seren wurde ein isotypspezifischer ELISA verwendet.
Zunächst wurde eine Flachbodenmikrotiterplatte (Nunc Immuno Plate) über Nacht mit
einem CSFV-E2 Glycoprotein (300 ng/Vertiefung) beschichtet. Anschließend wurde
die Platte 4 mal mit einer PBS-Tween-Lösung (PBS mit 0,1 % Tween) gewaschen und
die Seren in Verdünnungen von 0, 1:50 und 1:100 in PBS-Tween mit 3 % BSA
aufgetragen. Nach 1stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde 4 mal mit PBS-
Tween-Lösung gewaschen und die Platte mit einem Maus-anti-Schwein-IgG1 bzw.
IgG2 Antikörper inkubiert (IgG1 1:200, IgG2 1:500, in PBS-Tween mit 3 % BSA).
Nach Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur wurde die Platte erneut 4 mal mit PBS-
Tween-Lösung gewaschen, mit einem anti-Maus-Peroxidase konjugierten Antikörper
(1:1000 in PBS-Tween mit 3 % BSA) versetzt und 1 h bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach 4 weiteren Waschschritten wurde eine Substratlösung zugegeben. Als Substrat
diente in Citratpuffer gelöstes Othophenylendiamin (OPD), das mit 1µl/5ml H2O2
versetzt wurde. Die Umsetzung des Substrates durch die Peroxidase des Konjugates in
Form einer Farbreaktion erfolgte bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nach ca.15 min
wurde die Reaktion mit 2 M H2SO4 gestoppt. Die Bestimmung der OD-Werte erfogte
mit Hilfe eines ELISA-Readers (Titertek) bei einer Wellenlänge von 492 nm.
6.12.3.3 IFN-γ ELISA
Zum Nachweis von IFN-γ im Zellkulturüberstand wurde ein Enzymimmuntest (swine-
IFN-γ-Cyto-Set) verwendet. Der Test wurde nach Angaben des Herstellers
durchgeführt.
130