PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

METHODEN
L1-Puffer: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,1 mM EDTA (pH 8), 20 mM
ß-Mercaptoethanol, 1 mM Pefablock, 5 % Glycerin, 1
mg/ml Lysozym
Waschpuffer : 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 0,1 mM EDTA (pH 8), 20 mM
ß-Mercaptoethanol, 1 mM Pefablock, 5 % Glycerin, 0,5 M
NaCl, 0,03 M Imidazol
Elutionspuffer: Waschpuffer mit 350 mM Imidazol
Auftrag SDS-PAGE: Bakterienlysat: 8 µl
ÜL1 12 µl
Durchfluß-/Wasch-/Elutionsfraktionen: je 20 µl
6.9 Denaturierende Aufreinigung rekombinanter Fusionsproteine
über Ni 2+ -NTA-Agarose
Die mittels pQE-51- oder pGEX-System bakteriell exprimierten Fusionsproteine
wurden nachfolgend denaturierend über Ni 2+ -NTA-Agarose affinitätschromato-
graphisch gereinigt. Transformierte M15 wurden 3 h nach Induktion pelletiert
(5000 rpm, 10 min, 4°C), der Überstand verworfen und das Pellet in 20 ml Puffer A
resuspendiert. Nach Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur [Crowe & Henco et al.,
1992] wurde das Bakterienlysat 3 mal 3 min beschallt und anschließend für 15 min bei
14 000 rpm und 4°C (JA-17 Rotor) zentrifugiert. Der lösliche Überstand wurde
nachfolgend für die Affinitätschromatographie eingesetzt. Die Ni 2+ -NTA-Säule wurde
nach Angaben des Hersteller (Qiagen) mit 2 ml einer 50%igen Ni 2+ -NTA-Agarose-
Suspension gepackt. Nach Äquilibrieren der Säule mit Puffer A wurde der zuvor mit
Puffer A 1:1 verdünnte Überstand auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde
nachfolgend mit 10 ml Waschpuffer gewaschen. Die Durchfluß- und Waschfraktionen
wurden getrennt aufgefangen und für die gelelektrophoretische Analyse bei 4°C
aufbewahrt. Die Elution der Fusionsproteine erfolgte in 3 Schritten mit je 700 µl
Elutionspuffer B, C, D. Die einzelnen Fraktionen wurden in einer SDS-PAGE auf ihre
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