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METHODEN
12000 rpm). Nach den Extraktionsschritten wurde die in der wäßrigen Phase gelösten
Nukleinsäuren mit Ethanol präzipitiert.
6.3.3 Ethanolpräzipitation
Für die Fällung von DNA wurde die wäßrige Nukleinsäurelösung mit 1/10 Volumen
3 M Natriumacetat (pH 5,2) und 2,5 Volumen 100%igem Ethanol versetzt und 15 min
bei RT präzipitiert. Nach Zentrifugation (10 min, 12000 rpm) wurde das Pellet mit
70%igem Ethanol gewaschen, getrocknet und je nach Verwendungszweck in H2O oder
Puffer aufgenommen. Die Präzipitation von RNA erfolgte mit 1/10 Volumen 4 M
Lithiumchlorid und 3 Volumen kaltem 100%igem Ethanol. Nach Inkubation für 30
min bei –70°C oder 2 h bei –20°C wurde die gefällte RNA bei 4°C abzenrifugiert (15
min, 12000 rpm) und mit kaltem 70%igen Ethanol gewaschen. Das bei RT getrocknete
Pellet wurde anschließend in RNase freiem H2O aufgenommen.
6.4 Präparation, Analyse und Modifikation von DNA
6.4.1 Agarosegelelektrophorese
Für die gelelektrophoretische Auftrennung von DNA wurden je nach Größe der zu
trennenden Moleküle 0,7-2%ige horizontale Agarosegele mit 1x E-Puffer als Gel- und
Elektrophoresepuffer eingesetzt [SAMBROOK, 1989]. Nach Versetzen der Proben mit
DNA-Probenpuffer erfolgte die Auftrennung bei einer konstanten Spannung von
5 V/cm. Nach der Elektrophorese wurden die Gele für 10 min in Ethidiumbromid-
Lösung (0,5 µg/ml) gefärbt und nachfolgend kurz gewässert. Die Detektion von DNA-
Fragmenten, die aus dem Gel isoliert und weiterführend verwendet wurden, erfolgte
auf einer Leuchtplatte mit langwelligem UV-Licht (λ=366 nm). Für photographische
Aufnahmen wurde ein digitales Geldokumentationssystem eingesetzt, bei welchem die
Gele bei kurzwelligem UV-Licht (λ=254 nm) analysiert wurden.
20 x E-Puffer: 800 mM Tris, 400 mM Natriumacetat, 40 mM EDTA, mit
Eisessig auf pH 8,3 eingestellt
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