PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

METHODEN
Reaktions“kugeln“ enthalten alle benötigten Reaktionssubstanzen mit Ausnahme der
jeweils eingesetzten DNA-Matrize sowie dem entsprechenden Primerpaar. Nach
Zugabe dieser fehlenden Komponenten wurde der Reaktionsansatz mit H2O auf 25 µl
aufgefüllt und die lyophylisierten „PCR-Kugeln“ darin gelöst.
• Reaktionsansatz für die Analyse isolierter Gene :
0,4 µl Plasmid DNA
+ je 25 pmol seq/rev Primer
PCR-Zyklus Denaturieren 1: 1 min, 94°C
Denaturieren 2: 30 s, 70°C
Annealing: 1 min, 60°-64 o C
Elongation: 1 min, 72°C
Nach jeweils 30 Zyklen wurden die Reaktionen durch Kühlen auf 4°C abgebrochen. Je
1/10 der PCR-Ansätze wurde anschließend gelelektrophoretisch analysiert.
6.4.10 Präparation von Plasmid-DNA
6.4.10.1 Analytische Isolierung von Plasmid-DNA
„Schnellminipräparation“ bakterieller Plasmid-DNA [LE GOUILL, 1991]
Für eine schnelle Überprüfung von transformierten Bakterienklonen auf das
Vorhandensein rekombinanter Plasmide kann mittels dieser Schnellmethode Plasmid-
DNA direkt aus Bakterienkolonien, die auf einer Agarplatte angezogen wurden,
isoliert werden. Die Bakterienklone werden hierbei mit einer Pipettenspitze direkt von
der Agarplatte gepickt und in einem Eppendorfgefäß in 16 µl Lysepuffer
resuspendiert. Nach Zugabe von 3 µl Lösung 2 wird für 4 min bei 14000 rpm
zentrifugiert und der gesamte nukleinsäurehaltige Überstand in einem Agarosegel
aufgetrennt.
Lysepuffer: 9 Vol. 10x Auftragspuffer, 11 Vol. H2O,
40 Vol. 0,2 N NaOH/1%SDS
10x Auftragspuffer: 0,25% Xylencyanol, 0,25% Bromphenolblau,
25% Ficoll 400
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