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METHODEN 6.12.4.3 Charakterisierung von Leukozytenpopulationen mit Hilfe der Durchflußzytometrie Die unterschiedlichen Leukozytenpopulationen wurden durch Fluoreszenzmarkierung von zellspezifischen Oberflächenantigenen nachgewiesen. Die fluoreszenzmarkierten Zellen wurden im Durchflußzytometer (fluorescence activated cell sorter, FACS) analysiert. Immunfluoreszenzmarkierung von Zellen Um den Phänotyp von B-Zellen zu charakterisieren wurde eine Dreifarbenimmunfluoreszenz durchgeführt. 100 µl Volblut wurden nach folgendem Protokoll markiert: 1. Inkubation mit jeweils 50 µl anti swine-CD21Antikörper (mAk) 2. Inkubation mit jeweils 50 µl von folgendem isotypspezifischen Antikörpern:goat- anti maus αIgG1-PE Alle Inkubationsschritte wurden für 20 min bei 4 °C durchgeführt. Nach jedem Inkubationsschritt wurden die Zellen zweimal mit je 1 ml FACS-Puffer gewaschen und zentrifugiert (5 min, 500 x g). Die markierten Zellen wurden in FACS-Puffer resuspendiert und 2,5x10 4 Zellen pro Probe im Durchflußzytometer analysiert. PBMC, die mit den bei Schritt 2 eingesetzten Fluorochromkonjugaten markiert worden waren, dienten als Kontrolle. Alle Antikörper und Konjugate wurden vor ihrer Verwendung in der Durchflußzytometrie austitriert und in FACS-Puffer entsprechend verdünnt. Durchflußzytometrische Analysen Die fluoreszenzmarkierten Zellen wurden mit einen Durchflußzytometer, das mit einem Argon- und Helium-Neon-Laser ausgerüstet war, analysiert. Streulicht- und Fluoreszenzsignale einzelner Zellen wurden mit Hilfe spezifischer Detektoren gemessen. Die Streulichtparameter enthalten das Vorwärtsstreulicht und das Seitwärtsstreulicht. Das Vorwärtsstreulicht (forward scatter, FSC) definiert Zellpopulationen aufgrund ihrer Größe. Das Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSC) 132
METHODEN stellt ein relatives Maß für die intrazelluläre Granulation der Zellen dar. Durch weitere fluoreszenzabhängige Parameter können Oberflächenantigene sichtbar gemacht werden. Dabei wird die Fluoreszenzintensität von Fluoreszeinisothiocyanat (FITC), Phycoerythrin (PE) und Cy5 durch die unterschiedlichen Wellenlängen des emittierten Lichtes unterschieden. Die Quantifizierung der Fluoreszenz- und Streulichtemissionen jeder einzelnen Zelle wurde gespeichert. Die Daten wurden anschließend mit Hilfe von Computerprogrammen (PC-Lysis und Cell Quest) ausgewertet. 6.12.5 Infektionsversuche ● Überprüfung der Wirksamkeit der Belastunginfektion 5 Schweine (Deutsche Landrasse) wurden intramuskulär mit je 1 mg Plasmid-DNA immunisiert und anschließend intramuskulär (i.m.) und intranasal mit 2 x 10 5,5 TCID50 CSFV (Stamm Eystrup) infiziert. Plasma bzw. Serum und Blutproben wurden vor Infektion und zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion entnommen. 6.12.6 Immunisieungsversuche 28 Schweine (Deutsche Landrasse) wurden intramuskulär (i.m.) mit je 1 mg Plasmid- DNA immunisiert. Die Tiere wurden 2 mal im Abstand von 22 Tagen, mit je 1 mg Plasmid-DNA, geboosted und nach weiteren 22 Tagen einer Belastungsinfektion mit 2 x 10 5,5 TCID50 CSFV (Stamm Eystrup) unterzogen. Plasma bzw. Serum und Blutproben wurden vor Infektion und zu bestimmten Zeitpunkten nach der Infektion entnommen. 133
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DNA-Vakzinierung gegen classical sw
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Die vorliegende Arbeit wurde unter
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3.3 Analyse der DNA-Vakzine-Konstru
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6.5 Präparation und Analyse von RN
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ABKÜRZUNGEN 6xHis Hexahistidin Abb
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1 ZUSAMMENFASSUNG ZUSAMMENFASSUNG D
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2 EINLEITUNG 2.1 DNA-Immunisierung
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EINLEITUNG Proben erforderlich) ein
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EINLEITUNG Zellproliferation und Di
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2.3 Interleukin 18 2.3.1 Struktur E
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2.4 CD40-Ligand 2.4.1 Struktur EINL
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EINLEITUNG 2.5.2 Genomorganisation
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3 ERGEBNISSE 3.1 Konstruktherstellu
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ERGEBNISSE 3.1.2 Herstellung der E2
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ERGEBNISSE Abb. 3-3: RT-PCR für di
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ERGEBNISSE Abb. 3-4: Konstruktion d
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ERGEBNISSE Zur Entnahme der komplet
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ERGEBNISSE Nach Abschluß der Konst
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ERGEBNISSE Abb. 3-7: Gelanalyse der
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ERGEBNISSE Abb. 3-8: E2-Expressions
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ERGEBNISSE 3.2.4 Nachweis der IL-18
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%spezifische Lyse %spezifische Lyse
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ERGEBNISSE 1998; Smooker, 1999]. De
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ERGEBNISSE Von den Tieren wurden w
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• Serumneutralisationstest ERGEBN
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ERGEBNISSE • IgG1/IgG2-isotypspez
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ERGEBNISSE • IFN-γ-ELISA und IFN
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ERGEBNISSE Deshalb wurde im dritten
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ERGEBNISSE Vergleich der Tiere der
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ERGEBNISSE Konstrukte. Daher wurden
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ERGEBNISSE Antikörpertiter vor -un
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ERGEBNISSE 3.3.3.2 Klinischer Verla
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Temperatur 42 41,5 41 40,5 40 39,5
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ERGEBNISSE Gruppe Tier-Nr. 4. Tag 7
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ERGEBNISSE Antikörper und virusfre
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ERGEBNISSE mehrerer anderer Zellfra
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ERGEBNISSE Nach Transformation von
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ERGEBNISSE Abb. 3-27: Klonierungssc
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ERGEBNISSE 3.4.2.2 Expression der p
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ERGEBNISSE Aufgrund der geringen Au
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ERGEBNISSE CD40L (Abb. 3-35 A) spez
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ERGEBNISSE Abb. 3-36: Analyse resis
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ERGEBNISSE Abb. 3-37: Analyse der I
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1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
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ERGEBNISSE Abb. 3-40: E2-Expression
Seite 93 und 94: DISKUSSION E2-Poxvirus [Hahn, 2001]
Seite 95 und 96: DISKUSSION Der Nachweis der sekreti
Seite 97 und 98: DISKUSSION Testsystemen nach erfolg
Seite 99 und 100: DISKUSSION Versuchsansätzen wurde
Seite 101 und 102: DISKUSSION Zell-Depletion zu verzei
Seite 103 und 104: DISKUSSION p35-Untereinheit zeigte
Seite 105 und 106: 5 MATERIAL MATERIAL 5.1 Bakterienst
Seite 107 und 108: ● Linker MATERIAL SmaI SV40 Hpa I
Seite 109 und 110: MATERIAL Ziege-anti-Kanninchen IgG,
Seite 111 und 112: 5.8 Radioaktive Substanzen MATERIAL
Seite 113 und 114: 5.10.1 Zentrifugen MATERIAL Biofuge
Seite 115 und 116: 6.1.3 Transformation METHODEN Für
Seite 117 und 118: Transfektionsmethoden METHODEN •
Seite 119 und 120: METHODEN 12000 rpm). Nach den Extra
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Seite 127 und 128: METHODEN konstante Geltemperatur vo
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Seite 131 und 132: METHODEN 6.6.2 Diskontinuierliche S
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Seite 135 und 136: METHODEN induzierbare Expression de
Seite 137 und 138: METHODEN Reinheit und ihren Protein
Seite 139 und 140: METHODEN ● Organe: Je 500 mg eine
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Seite 169: Persönliche Daten Name: Daniel Wie
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