PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

ERGEBNISSE
schwierig erwies, sollten zwei Konstrukte erstellt werden, von denen eines die
komplette CD40L-cDNA (CD40L + -Konstrukt) und ein anderes die cDNA ohne
Signal-Anker-Sequenz (CD40L - -Konstrukt, ohne AS: 1-44) enthielt.
Erwartungsgemäß sollte bei dem Konstrukt ohne Signal-Anker-Sequenz eine
Expression des porcinen CD40L als lösliches intrazelluläres Protein erfolgen, da eine
Verankerung in der Membran ohne Ankersequenz nicht möglich ist.
Aus diesem Grund wurde die cDNA des porcinen CD40L für das CD40L + -Konstrukt
mit den Primern CD40L-bak.seq/rev und für die Sequenz des CD40L - -Konstruktes mit
den Primern Anker.seq/CD40L-bak.rev aus dem pcDNA4HisMax-E2-CD40L-Plasmid
amplifiziert. Dadurch verkürzte sich bei dem CD40L - -Konstrukt die Sequenz N-
terminal um die 44 AS lange Signal-Anker-Sequenz. Außerdem wurden die für die
Klonierung erforderlichen Schnittstellen und ein, für die affinitätschromatographische
Reinigung des rekombinanten CD40L mittels Ni 2+ -NTA-Agarose notwendiges,
carboxyterminales Hexahistidin-Ende durch die verwendeten Primer eingeführt.
Nach Verdau mit den Restriktionsenzymen Sph I/Sal I wurden die Fragmente in den
ebenfalls Sph I/Sal I verdauten pQE-51-Vektor kloniert und die Spezifität des
Fragmentes durch Sequenzierung bestätigt (Abb. 3-25)
Abb. 3-25: Klonierungstrategie für die pQE-CD40L-Expressionsplasmide. Für die
Herstellung der CD40L-Konstrukte wurde das CD40L-Fragment mit den Primern CD40Lbak.seq/rev
(CD40L + ) sowie Anker.seq/CD40L-bak.rev (CD40L - ) mittels PCR amplifiziert
und über die eingeführten Sph I/Sal I-Schnittstellen nach Verdau in den pQE-51-Vektor
inseriert. Bei beiden PCR-Fragmenten wurde zusätzlich ein Hexahistidin-Ende über den
Revers-Primer (CD40L-bak.rev) eingeführt.
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