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ERGEBNISSE vorhandenen E2-Vakzine-Vektoren inseriert werden. Als Plasmid für den Zwischen- klonierungsschritt wurde der pcDNA3-Vektor gewählt, da dessen Transkriptions- einheit einen CMV-Promotor enthält. Diese Tatsache ermöglichte uns, eine mögliche Differenz zwischen Transkriptionseinheiten mit homodimerer (CMV/CMV-Promotor) und heterodimerer (RSV/CMV-Promotor) Struktur zu analysieren. Für die Insertion der cDNA-Sequenzen der verschiedenen Immunmoleküle mussten zusätzliche Schnittstellen in den pcDNA3-Vektor eingeführt werden. Dieser wurde hierfür mit Kpn I und Stu I verdaut und anschließend Schnittstellen für BamH I, Not I, Xho I und Nru I über einen Oligonukleotidlinker (pcDNA3.seq/rev) inseriert. Die isolierte porcine IL-18 cDNA wurde mit den Primern IL-18-vac.seq/rev amplifiziert. Durch die verwendeten Primer wurden die für die weitere Klonierung benötigten Schnittstellen Kpn I und Not I eingeführt, das resultierende Fragment verdaut und in den analog behandelten pcDNA3-Linker-Vektor kloniert (Abb. 3-4). Die Amplifikation der cDNA des porcinen CD40L erfolgte mit Hilfe der Primer CD40L-vac.seq/rev, wodurch es möglich war, die Schnittstellen für Kpn I und Not I einzuführen. Anschließend wurde das PCR-Fragment Kpn I/Not I verdaut und in den ebenso behandelten pcDNA3-Linker-Vektor inseriert (Abb. 3-4). Die polycistronische Transkriptionseinheit des p35/p40-Heterodimers (IL-12) war schon partiell durch Vorarbeiten [Wienhold, 1998] vorhanden. Diese wurde für anderweitige Untersuchungen verändert (Dr. Heller, Roche) und die p35-IRES-p40- Sequenz anschließend aus dem pVDB3-swi-IL-12-Plasmid entnommen. Zur Isolation des IL-12 (p35-IRES-p40) musste das pVDB3-swi-IL-12-Plasmid mit Sal I und anschließend partiell mit BamH I verdaut werden. Das resultierende Fragment wurde über BamH I und Sal I in den pcDNA3-Linker-Vektor inseriert (Abb. 3-4). 20
ERGEBNISSE Abb. 3-4: Konstruktion der pcDNA3-IL-18-/ IL-12-/ CD40L-Vektoren. Zur Einführung zusätzlicher Schnittstellen für BamH I, Not I, Xho I und Nru I wurde das pcDNA3-Plasmid mit Kpn I/Stu I verdaut und ein Oligonukleotidlinker (pcDNA3.seq/rev) eingeführt. Nach Amplifikation der porcinen IL-18 cDNA (IL-18-vac.seq/rev) sowie des porcinen CD40L (CD40L-vac.seq/rev) wurde mit Primern die Schnittstellen für Kpn I und Not I eingeführt, und die verdauten Fragmente in das analog vorbereitete pcDNA3-Linker–Plasmid eingesetzt. Die p35-IRES-p40-Sequenz des IL-12 wurde durch Sal I und partiellen BamH I-Verdau aus dem pVDB3-swi-IL-12-Plasmid entnommen und über BamH I und Xho I in das pcDNA3- Linker-Plasmid subkloniert. 21
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1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
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DISKUSSION E2-Poxvirus [Hahn, 2001]
Seite 95 und 96:
DISKUSSION Der Nachweis der sekreti
Seite 97 und 98:
DISKUSSION Testsystemen nach erfolg
Seite 99 und 100:
DISKUSSION Versuchsansätzen wurde
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DISKUSSION Zell-Depletion zu verzei
Seite 103 und 104:
DISKUSSION p35-Untereinheit zeigte
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5 MATERIAL MATERIAL 5.1 Bakterienst
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● Linker MATERIAL SmaI SV40 Hpa I
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MATERIAL Ziege-anti-Kanninchen IgG,
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5.8 Radioaktive Substanzen MATERIAL
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Transfektionsmethoden METHODEN •
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METHODEN 12000 rpm). Nach den Extra
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METHODEN Reaktions“kugeln“ enth
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METHODEN peratur inkubiert. Nach Zu
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METHODEN konstante Geltemperatur vo
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METHODEN 6.5.2 RNA-Agarosegelelektr
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METHODEN 6.6.2 Diskontinuierliche S
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METHODEN Nitrozellulosemembran in 3
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METHODEN induzierbare Expression de
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METHODEN Reinheit und ihren Protein
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METHODEN ● Organe: Je 500 mg eine
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6.12.3.4 Serumneutralisationstest M
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METHODEN stellt ein relatives Maß
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ANHANG 610 630 650 TCGGAGAGAATCTTAC
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LITERATUR Birnboim, H.C., Doly, J.
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