PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

ERGEBNISSE
Abb. 3-27: Klonierungsschema für das pQE-p40 - -Expressionsplasmid. Die Konstruktion des
pQE-p40 - -Plasmides erfolgte durch Subklonierung eines mit den Oligonukleotidprimern p40bak.seq/rev
durch PCR amplifizierten p40 - -Fragments, welches mit den Restriktionsenzymen
Nco I und Bgl II verdaut und anschließend über diese Schnittstellen in den pQE-60 Vektor
integriert worden war.
Die Überprüfung der Spezifität des inserierten Fragmentes erfolgte durch
Sequenzierung. Anschließend wurde das Plasmid in E.coli transformiert und die
Kulturen mit 0,8 mM IPTG induziert. Nach Induktion konnte man beim
Gesamtzelllysat der induzierten Kultur, im Gegensatz zur nicht induzierten Kultur in
einem Coomassie-gefärbten PAA-Gel, eine deutliche Expression feststellen (Abb. 3-
28 A).
Bei der Reinigung gelang es allerdings nicht, das rekombinante Protein mit diversen
getesteten Lysepuffern der nativen oder denaturierenden Aufreinigung in Lösung zu
bringen (Daten nicht gezeigt). Diese Tatsache machte es unmöglich, das Protein
mittels Affinitätschromatographie zu reinigen. Daher wurde das Gesamtzelllysat über
ein präparatives PAA-Gel aufgetrennt und die spezifische Proteinbande nach
Coomassie-Färbung aus dem Gel ausgeschnitten. Anschließend erfolgte die
Elektroelution des Proteins aus dem Gel mittels einer Biotrap-Apparatur (Abb. 3-28
B).
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