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METHODEN
Lösung 2: 3 M Kaliumacetat, 1,8 M Ameisensäure
Plasmid-Schnellpräparation [BIRNBOIM, 1979]
3 ml LB-Medium, komplettiert mit dem entsprechenden Antibiotikum, wurden hierfür
mit einer transformierten Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 37°C kultiviert.
Je 1 ml dieser Übernachtkultur wurde kurz abzentrifugiert (5 min, 6000 rpm) und das
Pellet in 100 µl Lösung A resuspendiert. Die alkalische Lyse der Zellen erfolgte
anschließend durch die Zugabe von 100 µl Lösung B und nach kurzem, vorsichtigen
Mischen durch die Zugabe von 150 µl Lösung C. Proteine und chromosomale DNA
wurden hierbei präzipitiert und nach Inkubation der Proben für 20 min auf Eis
abzentrifugiert (15 min, 14000 rpm). Die Plasmid-DNA des Überstandes wurde für 15
min bei Raumtemperatur mit 3 Vol. 100%igem Ethanol gefällt, nach Zentrifugation
(15 min,1400 rpm) mit 75%igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in
50 µl TE-Puffer mit 10 µg/ml RNase A aufgenommen. Nach Abdau der RNA bei
37°C für 30 min wurden je 2 µl der Proben im Agarosegel analysiert.
Lösung A: 50 mM Glucose, 25 mM Tris/Cl pH 8,0,
10 mM EDTA, 2 mg/ml Lysozym
Lösung B: 0,1 N NaOH, 1% SDS
Lösung C: 3 M Na-Acetat pH 4,8
TE-Puffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA
6.4.10.2 Präparative Isolierung von Plasmid-DNA
Zur Isolierung größerer Mengen reiner Plasmid-DNA, wie sie für Klonierungen,
Sequenzierungen oder Transfektionen benötigt wurden, erfolgte die Präparation mit
dem Plasmid Midi Kit von Qiagen nach Anleitung des Herstellers oder für Mengen ab
4 mg durch Maxipräparation.
Maxipräparation
18 l einer Übernachtkultur wurden abzentrifugiert (5000 rpm, 5 Min., Rotor JA 10),
das Bakterienpellet in 1 l Lösung A resuspendiert und 20 Minuten bei Raumtem-
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