PDF 5.972kB - TOBIAS-lib - Universität Tübingen

METHODEN
1 µl RNase Inhibitor, 20 U/µl
2 µl T7 bzw. SP6 RNA-Polymerase, 20 U/µl
ad 20 µl H2O, DEPC-behandelt
Die Reaktion wurde für 2 h bei 37°C inkubiert.
Die Transkriptionsreaktionen wurden nachfolgend zur Entfernung der DNA-Matrize
mit 2 µl DNase I behandelt (15 min, 37°C). Nach Abstoppen des DNA-Verdaus mit 2
µl 0,2 M EDTA (pH 8,0) wurden die RNA-Transkripte mit 2,5 µl 4M LiCl und 75 µl
kaltem, 100 %igen Ethanol gefällt, mit 70%igen Ethanol gewaschen und bis zur
Verwendung bei –70°C aufbewahrt. Die Analyse der Transkripte erfolgte in
denaturienden RNA-Agarosegelen.
6.5.3.1 Gewinnung IL-18 und CD40L spezifischer Fragmente
Reverse Transkription
Für die reverse Transkription (RT) wurde pro Ansatz 10 µg Gesamtzell-RNA mit
4,5 pM Primer versetzt und durch fünfminütiges Erhitzen auf 65°C denaturiert.
Anschließend wurde der Ansatz 20 min bei 42°C inkubiert, um ein Annealing der
Primer zu ermöglichen. Für die Reverse Transkription wurde der Ansatz mit 5 µl 5x
RT-Puffer, 2,5 µl dNTPs (40mM) und 20 U RNAsin versetzt und mit H2O auf 25 µl
aufgefüllt. Gestartet wurde die Reaktion bei 42°C durch Zugabe von 20U Reverse
Transkriptase. Nach 30 min wurden weitere 20 U Reverse Transkriptase zugesetzt und
die Reaktion anschließend durch Hitzeinaktivierung gestoppt.
6.6 Protein-analytische Methoden
6.6.1 Konzentrationsbestimmung
Proteinbestimmungen wurden nach der Methode von BRADFORD (1976) mit dem
Proteinassay-Farbreagenz von Bio-Rad nach Angaben des Herstellers durchgeführt.
Zu 800 µl Probenvolumen (≤ 25 µg Protein) wurden je 200 µl Farbreagenz zugegeben
und sorgfältig vermischt. Nach 10 min wurde die Extinktion bei 595 nm gemessen und
die Proteinkonzentration der Probe durch Vergleich mit zuvor durchgeführten BSA-
Standardreihen bestimmt.
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